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菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)是世界上最重要的观赏花卉之一,也是我国有十大传统名花和世界四大鲜切花之一,具有观赏、食用、药用等多种价值。植物的萜类化合物的合成途径有两条:一条为甲羟戊酸途径(MVA pathway),该途径中所有的反应均在细胞质中进行;另一条为丙酮酸/磷酸甘油醛途径(MEP pathway),该生物合成途径是在植物特有的细胞器-质体中进行,由于DXP是该途径的关键前体,故该途径简称DXP途径。DXS和GGPPS都是该途径中的关键酶,采用干涉GGPPS和超表达DXS,希望获得具挥发性香味的菊花。
本实验构建pMOGMON-DXS植物表达载体和GGPPS的RNA干涉表达载体,并采用农杆菌介导的叶盘法转化菊花,获得的主要结果如下:
1.优化根癌农杆菌介导的菊花的遗传转化体系。研究表明,菊花叶块预培养3天,用OD600值为0.5的农杆菌菌液侵染8min,共培养2-3天,筛选和生根培养中采用500mg/L的头孢霉素或者羧苄青霉素作为抑菌性抗生素;15-20mg/L的潮霉素是供试菊花叶片外植体的临界耐受浓度。
2.通过特异引物从菊花中克隆出GGPPS的cDNA片段,并构建了其pYLRNAi2干涉表达载体用于转化菊花叶片,经潮霉素筛选后获得抗性植株。利用了该基因的通用引物和潮霉素引物对所获得的抗性植株进行了PCR检测。
3.利用载体pMOGMON载体构建了pMOGMON-DXS植物表达载体。采用农杆菌介导的叶盘法转化菊花,经潮霉素筛选后获得抗性植株。利用该基因的通用引物和潮霉素引物对所获得的抗性植株进行了PCR检测。
4.采用项空固相微萃取和气相色谱-质谱(GC-MS)技术,对菊花的对照和抗性植株叶片的挥发性成分进行定性定量分析,结果表明菊花DXS超表达植株中,倍半萜类物质的含量有所增加,特别是倍半水芹烯挥发量增加40多倍;菊花干涉表达GGPPS的植株中有芹子烯、杜松烯、姜黄烯、绿叶烯等新的倍半萜类物质形成。