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目的:利用组织工程学构建的三维皮肤替代物可以模拟人体皮肤的生物学功能,具有广阔的应用前景。然而,在构建过程中,一些异源性成分的使用大大限制了三维皮肤替代物在未来的临床应用。因此,本研究拟筛选角质形成细胞培养条件,利用无异源体系培养的角质形成细胞(KC)与成纤维细胞(HDF)和脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)进行共培养,优化构建人三维皮肤替代物。方法:首先,比较了3T3-J2饲养层、层粘连蛋白LN-511和重组人胶原I三种不同条件下培养的角质形成细胞的体外特征。随后,利用三种不同条件下培养的角质形成细胞,在Alvetex Scaffold支架上与成纤维细胞共培养,构建三维皮肤替代物,并通过提气-液平模拟表皮角化过程。通过HE染色、免疫荧光染色,qPCR方法鉴定三维皮肤替代物是否具有正常人类皮肤的表真皮特征。最后,通过添加脐静脉内皮细胞尝试构建具有血管的三维皮肤替代物,并观察三种细胞共培养对表皮层生长的影响。结果:1.角质形成细胞在三种培养条件下呈现不同的生长模式,其中在3T3-J2饲养层上呈克隆样生长,而在LN-511和胶原I上呈非克隆样增殖。qPCR和免疫荧光染色结果提示,三种条件培养的角质形成细胞的干性标记物KRT14、KRT5、KRT15、P63及分化标志物KRT1、KRT10的表达无显著差异。2.利用表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞能构建出具有表皮和真皮结构和功能的三维皮肤替代物。qPCR显示其表达与正常皮肤水平相近的角质形成细胞干性基因。而免疫荧光染色结果提示,构建的三维皮肤能够表达表皮层标记物(KRT14、KRT15、KRT10、LOR)、基底膜标记物(Collagen IV、Collagen VII、Laminin、CD49f)及真皮层标记物(Collagen I、Vimentin V9)。3.成纤维细胞与脐静脉血管内皮细胞在二维共培养时,观察到两种细胞能够共同生长,免疫荧光染色结果观察到间质细胞标记物CD44及血管标记物CD31的表达;qPCR结果提示添加脐静脉内皮细胞构建的三维皮肤替代物角质细胞干性基因表达较未添加者显著增高。结论:层粘连蛋白511和胶原I对角质形成细胞的长期培养均有强大的支持,与3T3-J2饲养层细胞的作用相当,且在这三种培养条件下,角质形成细胞的干性均能得到较长时间的维持。使用无异源体系培养的角质形成细胞和成纤维细胞共培养可在体外构建高度类似正常皮肤结构和功能的三维皮肤替代物,为今后的生产中去除异种细胞提供参考。脐静脉血管内皮细胞能与成纤维细胞共生长,且三种细胞共培养对表皮层的生长具有促进作用。