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锌作为一种结构、催化和信号成分,在生物体许多生理过程起着关键的作用。它也是病原细菌生长所必需的,不但参与各种代谢过程和毒力发挥,而且在感染宿主和定植过程中发挥重要作用。铜绿假单胞菌是一种条件致病菌,是医院内引发感染的最常见病原菌之一。目前在铜绿假单胞菌中已发现包括Znu ABC、HmtA、CntRLMN等多种锌离子摄取系统,这些摄取系统保证了铜绿假单胞菌在锌离子匮乏环境中尤其是在宿主体内的正常生长。虽然我们发现了铜绿假单胞菌CntRLMN锌离子摄取系统,但是Pseudopaline-Zn2+介导的锌离子摄取内膜转运蛋白是未知的。针对该问题,本研究对cntABCD操纵子作为Pseudopaline-Zn2+介导的内膜锌离子摄取的分子机制进行了鉴定和研究。首先通过生长曲线分析表明:限锌培养条件下,与znu BC突变株相比,在znu BC突变株的基础上单独突变cntL、cntABCD或同时突变cntL、cntABCD,这三种菌株间的生长受到显著抑制,但是三种菌株之间的生长并无明显差异的,这表明cntABCD操纵子参与了锌离子摄取且功能依赖于cntL,可能与cntL共同组成一套完整的锌离子摄取系统。限锌培养条件下在Δznu BCΔcntLΔcntABCD菌株中分别互补cntL和cntABCD后,其生长水平和Δznu BCΔcntLΔcntABCD并无明显差异,再次证明cntABCD的功能依赖于cntL而可能和cntL组成同一套锌离子摄取系统。然后通过lac Z转录融合的酶活分析显示cntABCD操纵子受锌离子摄取调控蛋白Zur的负调控,其表达以Zur蛋白依赖的方式受锌离子饥饿的诱导;凝胶迁移阻滞实验（EMSA）的结果显示在体外cntABCD操纵子的启动子可以与Zur蛋白结合形成DNA-蛋白质复合体,其结合位点为ATTCGTTATAACGTAACAA。上述研究表明cntABCD操纵子与铜绿假单胞菌的锌离子摄取相关,暗示cntABCD操纵子可能会影响铜绿假单胞菌锌离子相关的生理表型。为此本研究从体外和体内进一步研究了cntABCD操纵子与铜绿假单胞菌锌离子相关生理表型的关系。在加入钙网蛋白代替锌离子螯合剂后,Δznu BCΔcntABCD的生长显著慢于Δznu BC,与Δznu BCΔcntL生长情况类似,并且Δznu BCΔcntABCD互补cntABCD后恢复到Δznu BC的生长水平,即cntABCD操纵子介导了铜绿假单胞菌依赖于cntL的锌离子摄取,并且该操纵子与cntL属于同一套锌离子摄取系统。与cntL类似,突变cntABCD操纵子后虽然不影响铜绿假单胞菌胞外Las A蛋白酶和碱性蛋白酶的酶活性,并且在LB和M9培养条件下不影响铜绿假单胞菌生物被膜的形成,但是这不仅增强了铜绿假单胞菌对H2O2胁迫的敏感性,而且减弱了铜绿假单胞菌对大蜡螟幼虫的毒力。为了进一步探究CntA、CntB、CntC和CntD等蛋白各自在铜绿假单胞菌锌离子摄取过程中扮演的角色,本研究首先通过细菌双杂交实验研究了CntABCD中蛋白之间的互作关系,结果表明CntC分别与CntB、CntD互作,在铜绿假单胞菌内膜上CntB-CntC-CntD形成蛋白复合体。同时,周质空间蛋白CntD与外排泵MexAB-Opr M上的MexB互作,形成了CntD-MexB蛋白复合体。另外,CntD也与细胞质膜转运蛋白CntN互作形成CntD-CntN蛋白复合体。通过电感耦合等离子质谱分析显示周质空间蛋白CntA和CntD均不结合锌离子,同时进一步通过测定cntABCD操纵子中单独缺失突变株的生长曲线显示cntA参与铜绿假单胞菌的锌离子摄取,而cntD却无该功能,且单独缺失任何一个基因均不能完全废除cntABCD转运锌离子的功能。这些结果促使我们提出了CntABCD介导锌离子摄取的功能假设模型,即在周质空间CntA可能通过与锌载体Pseudopaline结合而将锌离子交给CntCB蛋白复合物并被进一步转运至细胞质,释放锌离子后的锌载体Pseudopaline则与CntD蛋白结合,并通过与MexAB-Opr M中的MexB互作,将Pseudopaline外排到胞外以循环使用;另外,胞内新合成的锌载体Pseudopaline通过CntN分泌到周质空间时,通过与CntD互作,CntN将Pseudopaline传递给CntD,再通过外排泵MexAB-Opr M泵到胞外而开始Pseudopaline的循环使用过程。综上所述:铜绿假单胞菌的CntABCD可能与CntRLMN的功能相耦联而共同构成一套完整的锌离子摄取系统。