【摘 要】
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目的:探讨榆干离褶伞溶栓酶（Lyophyllum ulmarium fibrinolytic enzyme,LUFE）对体外血小板活化的抑制作用及其作用机制。方法:从健康志愿者的肘部静脉采血至真空采集管中,提取血小板。以ADP/胶原/凝血酶诱导血小板的体外活化,将其分为正常对照组,激动剂组（ADP/胶原/凝血酶）以及LUFE不同剂量组。采用酶联免疫吸附法（Enzyme-linked imnuino
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目的:探讨榆干离褶伞溶栓酶（Lyophyllum ulmarium fibrinolytic enzyme,LUFE）对体外血小板活化的抑制作用及其作用机制。方法:从健康志愿者的肘部静脉采血至真空采集管中,提取血小板。以ADP/胶原/凝血酶诱导血小板的体外活化,将其分为正常对照组,激动剂组（ADP/胶原/凝血酶）以及LUFE不同剂量组。采用酶联免疫吸附法（Enzyme-linked imnuinosorbent assay,ELISA）检测LUFE预处理后血小板悬液中乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase,LDH）的活性;采用微量比浊法测定LUFE对ADP引起的血小板聚集的影响;采用ELISA法检测LUFE对胶原刺激后血小板分泌的血栓素B2（Thromboxane B2,TXB2）、C-C类趋化因子配体5（C-C chemokine ligand 5,CCL5）、血小板因子4（platelet factor 4,PF4）水平的影响以及血小板内1,4,5-三磷酸肌醇（inositol-1,4,5-triphosphate,IP3）、1,2-二酰基甘油（1,2-diacylglycerol,DAG）水平的影响;采用流式细胞术检测LUFE对胶原刺激后血小板Ca2+水平以及膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa（GPⅡb/Ⅲa）活化程度的影响;采用荧光染色法观察LUFE对血小板在固化胶原和纤维蛋白原上黏附和扩展的影响;观察LUFE对凝血酶引起的血小板斑块回缩的影响;采用蛋白免疫印迹法检测LUFE对胶原刺激后血小板GPVI-LAT-PLCγ/MAPK信号通路相关蛋白活化水平的影响。结果:（1）ELISA检测结果表明:（1）LUFE预处理后LDH活性无显著变化,即LUFE对血小板无毒性作用。（2）与激动剂组相比,LUFE对胶原诱导的TXB2、CCL5、PF4、IP3以及DAG水平的增高具有抑制作用。（2）血小板聚集实验结果显示:与激动剂组相比,LUFE预处理后血小板的聚集率显著降低。（3）流式细胞术检测结果表明:与激动剂组相比,LUFE可以抑制胶原引起的Ca2+水平的升高以及GPⅡb/Ⅲa的活化。（4）荧光染色法结果表明:LUFE可以减少血小板在固化胶原上的黏附及纤维蛋白原上的扩展。（5）斑块回缩结果表明:与激动剂组相比,LUFE对凝血酶引起的血小板斑块回缩具有抑制作用。（6）蛋白免疫印迹法结果显示:与激动剂组相比,LUFE可以抑制胶原引起的LAT、PLCγ、ERK以及JNK蛋白磷酸化水平的升高。结论:LUFE在体外抑制血小板活化,其作用机制可能与其调控GPVI-LAT-PLCγ/MAPK信号通路有关。
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