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研究背景和目的目前慢性肾脏病仍有很高的发病率,而终末期肾脏病(End stage renal disease,ESRD)患者的人群数量也呈逐渐增多趋势。心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是引起ESRD患者再住院和死亡的主要原因。而动脉钙化是心血管疾病患者全因和死亡的独立预测因素。在对ESRD患者进行前瞻性和横断面的研究中均显示血管中膜钙化是导致ESRD患者CVD发病率和死亡率增加的关键环节和独立危险因素。因此寻找干预血管中膜钙化的因素及其机制,对预防和延缓ESRD患者血管中膜钙化的发生发展,降低ESRD患者死亡率,提高其生活质量等具有重大意义。在引起血管中膜钙化的诸多因素中,高磷血症为始动因素,高磷可通过多种机制诱导血管中膜层的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)发生表型转化和凋亡,进而导致血管钙化的发生。探讨高磷因素诱导的血管中膜钙化的机制,并针对相应靶点采取有效的预防和治疗措施,对于降低ESRD患者死亡率具有重要意义。血管中膜钙化不是一个被动的过程,而是由细胞介导的高度可调的过程,其中血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的凋亡是血管中膜钙化发生的重要机制之一。SET8是一种能够导致细胞凋亡的赖氨酸甲基转移酶。SET8可甲基化p53、TWIST、Wnt等非组蛋白,并通过调节转录过程影响相应基因的表达,进而参与调控细胞周期、染色质固缩和DNA的复制。抑癌基因p53是目前发现的SET8最重要的非组蛋白底物,是重要的细胞周期和细胞凋亡调控因子。目前国内外有关SET8在高磷诱导血管平滑肌细胞钙化中的作用的研究较少。本课题研究SET8通过p53信号通路对大鼠VSMCs增殖及凋亡的影响,为预防血管中膜钙化的发生发展提供理论基础,为ESRD患者的血管中膜钙化的防治提供新思路和新靶点,以降低ESRD患者心血管事件及全因死亡率。材料与方法1 大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)的原代培养:选取100g～120g的SD大鼠,取胸主动脉进行原代培养,3～4代细胞供实验用,将第3代VSMCs铺六孔板,细胞融合率达60%～80%,即可进行干预。2 实验分组及干预:为了探究高磷诱导的VSMCs的凋亡及钙化情况,将VSMCs随机分为正常组和高磷组(10mmol/L β-甘油磷酸),培养4d。为了进一步探究SET8对细胞凋亡的调控作用,将VSMCs随机分为3组:①SET8-shRNA组:转染SET8特异性shRNA。②空质粒组:转染阴性对照shRNA;③正常对照组:加入10%胎牛血清的DMEM完全培养基。3 应用RT-PCR和Western Blot方法检测干预后各组VSMCs的SET8、p53、Bc12、Bax、Caspase3基因和蛋白的表达。应用免疫荧光双染法检测干预后各组中SET8和Caspase3的表达。4 采用茜素红染色、钙含量测定检测干预后各组VSMCs钙化的生物学指标。5 MTT和流式细胞法检测干预后各组VSMCs增殖和凋亡的生物学指标。6 统计学处理:应用SPSS19.0统计软件进行数据处理,计量资料呈正态分布的以均数±标准差(x±s)表示,多组间的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK检验,相关性采用Pearson相关分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果1 高磷诱导血管平滑肌细胞凋亡及钙化1.1 VSMCs的原代细胞鉴定:细胞SM22α免疫组化染色可见细胞浆内呈棕黄色,胞质内的肌动蛋白被染成棕黄色,呈丝状沿细胞长轴平行分布,细胞核为蓝色,SM22 α染色为阳性,表明细胞为血管平滑肌细胞。1.2 高磷组橘红色钙化结节比正常组显著增多,且钙盐沉积显著增加(P<0.05)。1.3 MTT法检测高磷对VSMCs增殖能力的影响:结果显示,与正常组比较,高磷组于24h、36h、48h细胞增殖能力降低,差异有统计学意义(P<0.05)。1.4 高磷对VSMCs凋亡的影响:流式细胞仪检测结果显示,与正常组比较,高磷组细胞凋亡显著增加;相关分析显示,凋亡和钙化呈正相关,差异有统计学意义(P<0.05)。1.5 高磷对VSMCs各指标mRNA表达的影响:PCR结果显示,与正常组比较,高磷组SET8和Bcl-2的mRNA相对表达量明显降低,P53、Caspase3、Bax的mRNA相对表达量明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。1.6 高磷对VSMCs各指标蛋白表达的影响:Western blot结果显示,与正常组比较,高磷组SET8和Bcl-2的蛋白相对表达量明显降低,P53、Caspase3、Bax的蛋白相对表达量明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。2 干扰SET8表达在血管平滑肌细胞钙化中的作用2.1 干扰SET8后,SET8-shRNA组与空质粒组和正常对照组相比,SET8的表达量显著降低(P<0.05)。2.2 干扰SET8后VSMCs的钙化情况:SET8-shRNA组橘红色钙化结节比正常对照组和空质粒组显著增多,且SET8-shRNA钙含量显著增加(P<0.05)。2.3 MTT法检测干扰SET8后VSMCs的增殖能力:VSMCs转染SET8质粒后,于0h、12h、24h、36h、48h时SET8-shRNA组细胞增殖能力较正常对照组和空质粒组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。2.4 流式细胞法检测结果显示:SET8-shRNA组凋亡细胞数较正常对照组和空质粒组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。相关分析显示,干扰SET8基因表达后,VSMCs的凋亡和钙化呈正相关,差异有统计学意义(P<0.05)。2.5 干扰SET8基因表达后,Bcl-2的mRNA表达水平下降,P53、Caspase3、Bax的mRNA表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。2.6 干扰SET8基因表达后,Bcl-2的蛋白表达水平下降,P53、Caspase3、Bax的蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。2.7 干扰SET8基因表达后,与正常对照组和空质粒组比较,SET8-shRNA组细胞胞浆中存在少量SET8表达,荧光强度明显减弱,SET8-shRNA组细胞胞浆中存在大量Caspase3表达,荧光强度明显增强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1 高磷可引起血管平滑肌细胞中SET8表达降低,血管平滑肌细胞发生凋亡,进而引起血管钙化。2 干扰SET8表达能够促进血管平滑肌细胞发生凋亡,进而促进血管钙化的发生。