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[研究背景及目的]溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)的病因和发病机制尚未完全明确。近来研究表明迷走神经通过释放乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)作用于α7烟碱型乙酰胆碱受体(alpha7 nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR),可抑制炎症反应,而UC患者存在迷走神经活动减弱的现象。我们通过建立葡聚糖硫酸钠(Dextran sodium sulfate,DSS)结肠炎模型鼠,探讨α7nAChR 激动剂 GTS-21能否改善结肠炎模型鼠的肠道炎症及其可能机制。[方法]1.动物实验1.1分组:选取6-8周龄雄性BALB/c小鼠32只,随机分为4组:CON空白对照组、DSS造模组、GTS-21干预组和α-BGT阻断组。DSS造模组于适应环境后三天,即给予3.5%DSS水自由饮用,连续7天;GTS-21组每天给予3.5%DSS水自由饮用的基础上予GTS-21(10mg/kg,ip);α-BGT阻断组每天在给予GTS-21之前半小时给予α-BGT(0.1mg/kg/day,ip);CON对照组予生理盐水,每天予DAI评分。1.2验证成模:自由饮用3.5%DSS水7天,每日观察小鼠精神状态、毛发光泽、粪便情况等,并进行DAI评分,第8天处死小鼠,观察其结肠大体变化,测其长度,HE染色组织学炎症(histology activity index,HAI)评分,评估模型鼠及对照鼠结肠炎性改变情况以验证成模。1.3肠道炎症状态评估:第8天处死小鼠,观察结肠大体变化,测其长度、湿重;取右半结肠组织进行石蜡包埋,切片,HE染色及组织学炎症(HAI)评分。1.4肠渗透性及细菌转位评估:FITC-Dextran法检测各组结肠通透性的变化;EUB338细菌探针荧光原位杂交技术(fluorescence in-situ hybridisation[FISH probe EUB338])检测各组小鼠肠壁细菌转位情况。1.5肠紧密连接(tightjunction,TJ)蛋白表达及分布的评估:荧光标记观察各组紧密连接蛋白位置的变化;Western blotting检测各组紧密连接蛋白(zo-1、claudin-1、occludin、jam-1)的表达。1.6 NF-κB相关蛋白表达及细胞因子测定:Western blotting检测NF-κB相关蛋白(P-p65、p65、IκB、P-IκB)的表达;ELISA检测各组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎细胞因子的表达。2.细胞实验部分2.1细胞的培养和传代:Caco2细胞用含有15%胎牛血清FBS(fetal bovine serum,Gibco)和1%双抗(青霉素和链霉素)维持生长,在37℃和5%CO2孵箱培养。隔天换液,三至四天传代。2.2细胞实验的分组:Caco2细胞分四组:CON正常对照组、TNF-α干预组、GTS-21干预组及α-BGT干预组。TNF-α干预组给予25ng/ml TNF-α,GTS-21干预组在给予TNF-α之前30min给予100ng/ml GTS-21,α-BGT干预组先后每隔30min 给予 50ng/ml α-BGT、100ng/ml GTS-21 及 25ng/ml TNF-α,正常对照组给予经过高压消毒的生理盐水,即α-BGT、GTS-21及TNF-α的溶剂。2.3 Western blotting分别检测给予上述相应干预后的Caco2细胞紧密连接蛋白(zo-1、claudin-1、occludin、jam-1);荧光标记观察各组紧密连接蛋白位置的变化。2.4 Western blotting 检测 NF-κB 相关蛋白(P-p65、p65、IκB、P-IκB)的表达及核转位实验检测NF-κB信号通路的激活水平。[结果]1.与正常对照组相比,DSS组模型鼠DAI评分增高,结肠缩短,HAI评分升高,表明造模成功。2.给予GTS-21的DSS组模型鼠,DAI评分下降,结肠长度较DSS组增加,HAI评分减低;给予GTS-21前予其阻断剂α-BGT的DSS鼠,DAI评分升高,结肠变短,HAI评分升高,其改变与DSS模型鼠类似。3.ELISA炎性细胞因子测定结果表明,DSS组鼠TNF-α、IL-1β、IL-6表达升高,而给予GTS-21的模型鼠,TNF-α、IL-1β、IL-6表达明显降低;给予GTS-21前予其阻断剂α-BGT处理的DSS鼠TNF-α、IL-1β、IL-6表达也增加。4.FITC-Dextran结果表明,DSS组鼠肠通透性增加,而给予GTS-21的DSS模型鼠屏障通透功能改善,给予GTS-21前再予其阻断剂α-BGT的DSS鼠屏障通透性增加;EUB338探针荧光原位杂交结果表明,细菌侵入DSS组小鼠的结肠粘膜层及粘膜下层,给予GTS-21可改善细菌的侵入。5.DSS组小鼠肠道紧密连接蛋白表达明显降低,结构破坏,而给予GTS-21 的 DSS 模型鼠紧密连接蛋白表达升高,分布改善;给予 GTS-21前再予其阻断剂α-BGT的DSS鼠紧密连接蛋白表达降低,结构破坏,其改变与DSS组类似。6.DSS组小鼠NF-κB激活程度增加,给予GTS-21的DSS鼠NF-κB激活减少;GTS-21组给予α-BGT后NF-κB激活复又增加,与DSS组类似。7.以TNF-α作为炎性刺激因子观察对肠上皮细胞TJ蛋白的影响,发现Caco2细胞TJ表达随加入TNF-α浓度的增加而减少,呈剂量依赖性,TNF-α最佳刺激浓度为25ng/ml。8.GTS-21改善TJ含量和分布:Western blotting及免疫荧光实验表明,与正常对照组相比较,TNF-α处理的Caco2细胞TJ表达下降、结构破坏,GTS-21处理的Caco2细胞TJ表达水平较TNF-α组明显升高,接近正常对照组水平;给予α-BGT加GTS-21处理的Caco2细胞TJ表达较GTS-21处理组明显下降。9.GTS-21抑制NF-κB激活:与对照组相比较,TNF-α组Caco2细胞NF-κB相关蛋白p65、Iκb磷酸化水平明显升高,核转位增加。给予GTS-21处理的Caco2细胞NF-κB相关蛋白磷酸化水平下降,核转位减少,接近正常对照组。α-BGT干预组NF-κB相关蛋白p65、Iκb磷酸化水平明显升高,核转位增加,接近TNF-α组。[结论]α7nAChR激动剂GTS-21能减轻DSS诱导结肠炎模型鼠肠道炎症,其可能是通过减少促炎因子IL-1β,IL-6,TNF-α的产生和改善TJ蛋白的表达,从而减少肠粘膜通透性,改善肠屏障功能实现,这个过程可能与GTS-21减少NF-kB 的激活有关。