即早基因c-fos在多发性梗死性痴呆大鼠脑内的表达前言多发性梗死性痴呆(Multiple Infarct Dementia，MID)是血管性痴呆的一种亚型，是脑部血管多发性梗死所致的以认知功能障碍为核心症状的获得性的临床综合征。随着世界人口的老龄化，脑血管病的发病率逐年上升，MID的发病率也随之升高。MID不仅严重损害患者健康，影响患者的生活质量，也给社会和家庭带来了沉重的负担，引起了世界各国的普遍关注。MID的病理机制主要与脑血管病变导致的局部或全脑缺血或缺氧后引起脑部与认知记忆等相关的特定神经组织损害有关。MID的分子机制涉及脑缺血后的损伤，是一个复杂的病理生理过程。近年研究发现脑血流中断和再灌注使脑组织细胞产生损伤级联反应，可能是启发或触发脑细胞死亡的主要机制，脑缺血后发生的级联反应至少涉及4个不同阶段：即能量衰竭和兴奋性氨基酸毒性、梗塞周围去极化、炎症反应、程序性细胞死亡(Programmed Cell Death，PCD)或细胞凋亡。学习和记忆是动物和人类生存所不可缺少的重要功能，是中枢神经系统的高级整合功能。学习是指人和动物不断接受环境变化的信息而获得外界知识(新的行为习惯或经验)的神经活动过程；而记忆则是将获得的知识进行储存和读出的神经过程；学习和记忆是两个互相联系的神经过程。与学习记忆有关的脑区有大脑皮质、海马、丘脑、边缘系统等，其中大脑皮质和海马是学习记忆的重要脑区。即早基因(Immediate Early Genes，IEGs)被认为是核内第三信使，将细胞外信号与效应基因较长时间的表达联系起来，并作为转录依赖性模板，甚至在脑缺血时作为很多缺陷蛋白的转录模板。C-fos基因是第一个被发现的即早基因，是编码核蛋白的基因。C-fos基因的功能是通过它所编码的Fos核蛋白实现的。①第三信使作用：Fos是真核细胞内的调控因子，在信号传导过程中起重要作用。②神经元保护作用：c-fos基因早期出现在缺血后存活的神经元中，参与神经元损伤后的早期反应。③Fos是c-fos基因表达的抑制剂。④在正常情况下，c-fos基因参与细胞生长、分化、信息传递、神经可塑性变化以及学习和记忆等生理过程；而在病理情况下c-fos基因表达及调控变化与多种疾病的发生和发展有关。MID动物模型最终的行为学表现为学习和记忆功能受损，因此对MID的研究主要是对学习记忆的研究。很多实验研究表明在学习记忆过程中c-los基因表达增强，尤其在长时记忆过程中c-fos基因表达增加；另有很多研究表明脑梗死后c-fos基因在中枢神经系统表达增多，推测c-fos基因可能参与脑梗死及MID的发生发展过程。实验材料与方法一、材料(一)实验动物及分组健康雄性Wistar大鼠，体重300-400g，随机分成正常对照组(n=8)假手术组(n=8)实验组：栓子注入后2h、4h、24h、5d、7d、15d、24d、30d组；其中15d、24d、30d组根据Morris水迷宫检测结果再分为多发性梗死性痴呆组(n均=8)和多发性梗死性非痴呆组(二)主要试剂10％水合氯醛；4％多聚甲醛；碘伏；生理盐水注射液；肝素钠注射液；TTC试剂；梯度酒精、二甲苯、苏木素、中性树胶、蒸馏水；c-fos试剂；SABC试剂盒；DAB显色试剂盒。(三)主要仪器设备显微外科手术器械一套、手术操作台；动脉夹；37℃温箱；石蜡切片机、石蜡包埋机；光学显微镜(OLYMPUS)；水浴箱；Morris水迷宫；4℃冰箱；显微图象分析系统(美国UIC公司Metamorph／Evolution MP5.0／BX51)；计算器。二、方法(一)模型制备具体过程参照陈俊抛等改良的微栓子法制备大鼠多发性脑梗死及MID模型。(二)模型成功判定标准1、TTC染色2、学习记忆能力评分(三)常规HE染色，光学显微镜观察脑组织的超微结构(四)免疫组织化学方法检测脑组织中c-fos基因的表达实验结果一、TTC染色结果正常对照组大鼠大脑呈均匀红色，实验组大鼠大脑可见点片状白色梗死灶。二、学习记忆能力结果MID组和正常对照组及假手术组的逃避潜伏期趋向不同。MID组大鼠定位航行实验的成绩落后于正常对照组及假手术组，P＜0.05。正常对照组、假手术组和MID组大鼠穿过平台所在位置的次数比较，MID组大鼠穿过平台所在位置的次数明显少于正常对照组及假手术组大鼠，P＜0.05。三、HE染色结果正常对照组大鼠脑组织皮质细胞层次分明，神经细胞形态结构正常。实验组大鼠大脑皮质神经元及海马锥体细胞坏死、脱失、胶质化，基底节区神经元减少，排列紊乱，细胞周围间隙增宽，有大量坏死神经元，胞体肿胀、胞浆淡染、胞核溶解，结构不清，梗死边界区可见大量固缩神经元。四、免疫组化染色结果正常对照组及假手术组c-fos免疫反应阳性细胞的平均光密度值较低，两者未见明显差异，P＞0.05。实验2h组c-fos免疫反应阳性细胞的平均光密度值略有增加，但与正常对照组及假手术组比较未见显著差异，P＞0.05，余实验组c-fos免疫反应阳性细胞的平均光密度值明显增加，与正常对照组及假手术组比较差异显著，P＜0.05，动态观察发现，大鼠多发脑梗死后4h c-fos免疫反应阳性细胞的平均光密度值开始增加，24h达高峰，以后有所下降，但至1个月左右仍较高，P＜0.05。但多发性梗死性非痴呆组和MID组进行比较未见显著差异，P＞0.05。讨论在正常情况下，c-fos基因参与细胞生长、分化、信息传递、神经元可塑性变化以及学习和记忆等生理过程；而在病理情况下c-fos基因表达及调控变化与多种疾病的发生和发展有关。Eugeniusz Nikolaev等在大鼠主动回避性学习记忆中，发现在长时记忆过程中大脑内c-fos mRNA表达增加。Wolfgang Tischmeyer等和Anokhin K．V等在研究学习记忆过程中也发现了c-fos mRNA表达增加。李之林在大鼠被动回避性学习记忆过程中也观察到Fos样蛋白的增加。近年有越来越多的文献报道在学习记忆过程中，尤其在长时记忆过程中的c-fos基因的表达增加。本实验结果显示：正常对照组及假手术组均有少量c-fos免疫反应阳性细胞表达，两者未见明显差异。实验2h组c-fos免疫反应阳性细胞表达略有增多，但与正常对照组及假手术组比较未见显著差异，余实验组c-fos免疫反应阳性细胞增多，与正常对照组及假手术组比较差异显著，而多发性梗死性非痴呆组和MID组进行比较未见显著差异。动态观察发现，大鼠多发脑梗死4h后c-fos表达开始增多，24h表达达高峰，以后有所下降，但至1个月左右仍呈高表达。提示c-fos基因可能参与多发性脑梗死及MID的发生发展过程，并在此过程中对神经元损伤具有保护性作用，这与有些学者研究的结果相似。但c-fos基因在多发性梗死性非痴呆大鼠的表达与MID组比较未见显著差异，这可能说明c-fos参与多发性梗死及MID的病理生理过程，也可能是c-fos仅在多发性脑梗死的发生发展过程发挥作用，而在MID的发生发展过程不发挥作用；也可能是多发性梗死性非痴呆组模型例数较少，不具有代表性，要进一步解决此问题，可以将样本量加大，有待于进一步实验证实。结论1、采用大鼠自体血栓制备多发性脑梗死及MID模型，通过TTC染色、HE染色及Morris水迷宫试验证明模型制备成功。2、C-fos基因在多发性脑梗死及MID大鼠脑内的表达增多，说明c-fos基因可能参与多发性脑梗死及MID的病理生理过程。3、C-fos基因在与学习记忆有关的脑区大脑皮质和海马表达增多，提示c-fos基因可能是学习记忆形成的基础。