目的:对比性研究猪自体软骨细胞低密度与高密度培养后,作为组织工程种子细胞,复合脱细胞小肠粘膜下层(Small Instestinal Submucosa,SIS),构建组织工程软骨,修复猪实验性软骨全厚缺损的效果观察,从而探讨不同组织工程软骨,修复实验性软骨缺损的可行性和效能,为进一步组织工程软骨的临床应用提供实验室依据。自备壳聚糖/胶原多孔支架(chitosan/collagen)检测其生物相容性。方法:1.收集2月龄猪膝关节软骨组织,用Ⅱ型胶原酶一次消化法消化、分离软骨细胞后,在单层高细胞密度下培养,获取软骨细胞,传代扩增,观察形态;绘制生长曲线,经免疫组织化学和Mallory染色、甲苯胺蓝染色鉴定;2.取猪小肠,按照Abraham方法略作修改脱细胞、脱蛋白和去除浆膜层、肌层,制备脱细胞的小肠粘膜下层,辐射消毒后保存备用;将培养至第三代的猪膝关节软骨细胞接种于SIS膜上,复合培养48小时,构建细胞-载体复合物,倒置显微镜、扫描电镜观察。3.制备壳聚糖/胶原多孔支架,辐射消毒后保存备用;用膜的浸提液测试其细胞毒性(MTT法)、致热源试验、溶血试验和过敏试验。将培养至第三代的猪膝关节软骨细胞接种于壳聚糖/胶原多孔支架上,复合培养48小时,构建细胞-载体复合物,倒置显微镜、扫描电镜观察。4.制作猪膝关节股骨髁软骨全厚缺损模型,随机分为四个组,第1、3组(1-12)右膝均为自体软骨细胞+SIS支架,第2组(1-6号)左膝为SIS空白支架组,第4组(7-12)左膝为全空白组。分别于术后16周取材行大体观察、HE染色、蕃红O-亮绿染色、甲苯胺蓝染色、Mallory染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,行大体评分,用Wakitani法进行组织学评分。结果:1.获得关节软骨40-50mg,“一步法”完全消化后收集细胞,总量为1.5-2.5×10~5个,活性率平均为96.4%。单层高密度培养至第三代细胞、获得细胞3.2×10~6个。经甲苯胺兰,Mallory染色及Ⅱ型胶原免疫组化均呈阳性反应;2.电镜观察SIS膜表面粗糙,纤维网状结构其中多空隙,膜表面孔隙大小100-400μm,软骨细胞在其孔隙内贴壁良好生长;HE染色见细胞在SIS基质层的表面呈单层或复层生长;免疫组织化学染色结果显示:在软骨细胞与SIS表面之间形成一条连续阳性表达条带;3.电镜观察壳聚糖/胶原多孔支架,表面粗糙,分布均匀的片状孔隙结构,该支架的孔隙大小50-300μm,孔与孔连接成了类似于骨的结构;少量软骨细胞黏附生长。其浸提液未引起溶血反应、过敏反应、发热反应;4.体内植入后16周,第1、3组关节软骨全层缺损得到修复,为透明软骨样修复,软骨和软骨下骨结构完整,新生组织与周围正常软骨融合。第2组修复组织变化较大,多为纤维组织或纤维软骨样组织,含血管组织;第4组未能修复缺损与周围的正常软骨整合不良,周围正常软骨有退变迹象。Wakitani病理评分提示第1、3组的各项评分结果组间没有统计学差异(P＞0.05),但优于第2、4组(P＜0.01);MRI扫描软骨缺损的分级显示1、3组的各项评分结果组间没有统计学差异(P＞0.05),但优于第2、4组(P＜0.01)。结论:1.单一胶原酶消化分离关节软骨细胞并采用高浓度聚集培养的方法既能获得足够细胞数量,又能较好地维持细胞分化表型,聚集培养可获得组织样细胞团块,为获得软骨组织工程种子细胞的一种可靠技术;传代培养的去分化软骨细胞,聚集培养可部分恢复细胞表型,从原代细胞开始进行聚集培养,或传代培养后再聚集培养,是较好的成熟关节软骨细胞体外培养方式;2.壳聚糖/胶原共混支架材料是软骨组织工程发展中的载体,但其制备和生物相容性还需进一步的实验改进;3.SIS是软骨组织工程良好的载体材料;结合自体软骨细胞构建的组织工程软骨,可修复猪关节软骨的全层缺损,修复组织主要为透明软骨样组织;单纯植入SIS和不植入任何材料,均不能修复猪关节软骨的缺损。