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肿瘤抑制基因(TSGs)启动子异常甲基化而引起的表达沉默在各种肿瘤的发病机制中起重要作用。作为 TSG 的 RASSF1A 在肺癌和其它恶性肿瘤中已得到广泛的研究;而 RASGRF2 和 FBN2 仅被报道在胰腺癌细胞的发病机理中起重要作用。 本研究的主要目的,一是明确 RASGRF2、FBN2 在肺癌发病中的作用,二是比较 RASGRF2 和 RASSF1A 之间有无联系。 本研究采用甲基化特异性的 PCR (MSP)分别检测 RASSF1A、RASGRF2 和 FBN2 在肺癌细胞、肺癌组织中的甲基化状态;并根据它们在肺癌组织中的甲基化状态结合临床资料进行分析。另外,还采用逆转录 PCR (RT-PCR)观察 RASGRF2 和 FBN2 mRNA 的表达,对RASGRF2 和 FBN2 mRNA 表达阴性并有异常甲基化的细胞株用5-Aza-CdR 处理后,观察基因是否能够重新表达。 方法: 1. 甲基化的检测 采用蛋白酶 K 消化,酚/氯仿抽提,乙醇沉淀的经典方法,从培养的肺癌细胞株,肺癌组织和癌旁正常肺组织中提取 DNA。取 1μg 的DNA 进行重亚硫酸钠修饰,纯化后的 DNA 用于 PCR 扩增。采用 MSP分析 RASSF1A、 RASGRF2 和 FBN2 是否存在启动子异常甲基化。 2.逆转录 PCR 观察基因表达 用一步法提取细胞肺癌细胞,正常气管、支气管上皮细胞,肺癌组织和癌旁正常肺组织中的 RNA。取 5μg 的总 RNA 进行逆转录制备cDNA,然后检测基因表达。用 β-actin 作为内参照检验逆转录成功与否。引物根据人的 RASGRF2 和 FBN2 基因 mRNA 序列设计引物,应用 RT-PCR 法扩增目的基因片段,观察其表达。正常气管、支气管上皮细胞作为阳性对照。 所有 PCR 产物用含嗅化乙啶的 2%的琼脂糖凝胶电泳观察。 结果: 1. RASGRF2 在 36% (5/14)的肺癌细胞中表达降低,而在 29% (4/14) 肺癌细胞中存在异常甲基化。 2. RASGRF2 在肺癌细胞表达降低和异常甲基化的吻合率为86% (12/14);表达降低并有异常甲基化的细胞株经过 5-Aza-CdR处理后,RASGRF2 基因可以重新表达。 3. 与癌旁正常肺组织比,RASGRF2 在原发肺癌组织中的表达也明显降低。 4. 在原发 NSCLC,RASGRF2 和 RASSF1A 异常甲基化频率分别为 34% (39/114)、39% (44/114),而在正常癌旁肺组织中分别为 7% (4/57)和 0%。差异具有显著性(p<0.0001)。 5. RASGRF2 和 RASSF1A 的甲基化状态均和患者年龄、吸烟史、病理分类及存活期无关。 6. 无论是肺癌细胞还是肺癌组织,RASGRF2 和 RASSF1A 的