微拟球藻丙二酰CoA:ACP转酰基酶基因克隆及环境胁迫条件下脂肪酸组成变化研究

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微拟球藻(Nannochloropsis ganada)在物种分类上被划归为褐藻门、大眼藻纲、单细胞藻类。其油脂含量最高可达占干重的60%左右,脂肪酸组成主要为C16和C18类。该藻被学者认为是最有希望用于生产油脂的海水藻。但目前关于其基因工程产油方面的研究还较少。针对微拟球藻不同生长时期转录信息的差异,运用Illumina高通量测序技术中的HiSeq2000平台,选择在不同生长时期的微拟球藻进行转录组学分析,然后从转录组文库中获得油脂合成过程中的关键基因—丙二酰CoA:ACP转酰基酶基因片段,利用Race技术获得该基因全长,并分析了微拟球藻(Nannochloropsis ganada)在不同生理状态下脂肪酸组成及MCAT基因的转录表达变化。转录组学研究表明:在微拟球藻(Nannochloropsis ganada)生长的指数期和平台期共获得29,203条高质量mRNA序列片段。在指数期,有9,745条mRNA序列表达上调,而在平台期有7,305条mRNA序列表达上调。指数期和平台期表达无差异的序列总共有12,153条。在NCBI数据库中,获得注释信息的序列有13,775条。而KEGG代谢通路数据库注释表明:指数期获得了238条代谢途径注释,其中有818条序列在这些代谢途径中表达上调。平台期获得了248条代谢途径注释,其中有1,148条序列表达上调。在COG数据库中有11604条序列(25亚类)获得注释。这些注释主要涉及脂质代谢、糖代谢、光合作用等等诸多生理生化过程。其中,指数期表达上调4,135条序列,在平台期表达上调5,015条序列。克隆结果表明:微拟球藻丙二酰CoA:ACP转酰基酶基因5`-UTR为158bp,3`-UTR为452bp,编码蛋白区长度为1059bp,NgMCAT基因编码352个氨基酸,编码蛋白的分子量为37.22kDa,等电点为6.06。系统进化树及氨基酸序列同源性分析发现微拟球藻丙二酰CoA:ACP转酰基酶的氨基酸序列和三角褐脂藻、海链藻等藻类丙二酰CoA:ACP转酰基酶氨基酸序列具有较高相似性。Real-time PCR结果表明:在富氮培养时,NgMCAT表达水平的变化不显著;而在缺氮条件下,NgMCAT的表达量在初始的12h内,逐渐增大,在12h时表达量最高,为初始0h的5.17倍。但从12h往后,NgMCAT表达量则逐步降低。在72h时候,NgMCAT基因的表达量仅为对照组0h的0.47倍,在12h时表达量达到最大值,为对照组0h的2.35倍。在低温下(15℃)下培养,NgMCAT表达量先急剧增加,在6h表达量最高,为0h的4.25倍。而后,随着培养时间的延长,NgMCAT的表达呈降低趋势,并且在36h及72h均低于正常培养时该基因的表达量。其中,NgMCAT在72h表达量最低,为0h的0.75倍。在富盐培养状态下,NgMCAT的转录水平呈现先上升后下降的趋势。在正常培养及富盐培养条件下,微拟球藻(Nannochloropsis ganada)脂肪酸组成中的C14:0, C16:1, C20:4, C20:5随着培养时间的延长而逐渐上升,但是,C16:0, C18:2, C18:1, C18:0等组分则表现出相反的趋势。在低温培养条件下,C14:0组分呈波动变化,而高温下则表现出先升高后降低的趋势,其组分含量最大值在24h。在低温及高温条件下,C16:0组分均表现很出随着培养时间延长而逐渐降低的趋势。但是在低温条件下降低速度更快。C18:0在低温及高温下均表现出先降低而后略微上升的趋势;在富氮条件下,C18:0表现出上升趋势;而在缺氮条件下,则表现出下降趋势。在限氮条件下,C16:1的含量随着培养时间的延长表现出显著的增长趋势;而C18:0和C20:4这两类组分则在富氮条件下随培养时间延长而增长,而在缺氮条件下则表现出随培养时间延长而降低的趋势。在缺氮和富氮条件下,C20:5均表现出下降趋势,但在缺氮条件下,其下降速率表现的更为明显。
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