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丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)是一种小包膜RNA病毒,主要经血液传播,可引起急、慢性病毒性肝炎,迁延不愈会导致肝硬化甚至肝癌,世界人口的3%即大约1.7亿人为HCV感染者,其中发展中国家高于发达国家,中国有近4千万HCV感染者,是HCV流行较严重的国家之一,HCV疫苗目前尚未研发成功,因此控制HCV的传播已成为一个相当严峻的公共卫生问题。HCV的检测方法有核酸检测法、免疫检测法等。HCV免疫检测法主要以第三代为主,即对抗HCV抗体进行检测。国外目前已经发展到了第四代,其属于抗原抗体联合检测,即在检测抗HCV抗体的同时对HCV核心抗原(CORE antigen)进行检测。第四代检测比第三代检测的窗口期更短,能够在病毒抗体产生之前检测出CORE抗原阳性的感染者。国内市场的第四代HCV检测试剂主要是国外公司的产品,国内产品还处于起步阶段,其检测性能和国外产品相比尚有较大差距,因此研发高质量的HCV第四代诊断试剂盒具有重要的临床意义和经济价值。本文的主要研究内容为成功构建了含HCV NS3和CORE抗原基因的重组高效表达质粒,并通过初步优化发酵条件,获得了稳定高表达的工程菌株;经过摸索及优化获得了较为理想的蛋白质纯化工艺,该工艺具有稳定、简便且能获得高纯度蛋白的优点,具有极大的应用价值;纯化后的蛋白经过活性检测,具有良好的生物学活性,为成功开发HCV Ag/Ab联合检测试剂盒打下了坚实的基础,成功构建的蛋白,在制备HCVAg/Ab联合检测试剂盒的时候,体现了很好的临床性能,与主流试剂相比灵敏度高,特异性好,在缩短丙型肝炎病毒检测窗口期方面,具有很大的临床意义,主要研究结果如下:1.通过提取HCV RNA,RT-PCR法获取了NS3(C33C)和CORE抗原(C60:CORE1-60aa)的基因编码片段,且克隆到载体pET-28a和pET-30a中,得到了两个不同的表达质粒pET-28a-NS3(C33C)-CORE(C60)、pET-30a-NS3(C33C)-CORE(C60),目标蛋白NS3(C33C)和CORE(C60)在BL21(DE3)菌株得到了大量表达。2.通过对BL21(DE3)pET-28a-NS3(C33C)-CORE(C60)、BL21(DE3)pET-30a-NS3(C33C)-CORE(C60)表达菌株的诱导剂浓度,诱导时间等工艺参数进行优化,确定了高密度发酵的培养和诱导条件。3.建立了适合放大的纯化工艺路线,确立了简便快捷可线性放大的纯化工艺,通过超声破菌、亲和层析、琼脂糖凝胶电泳层析方法,得到了高纯度的目标蛋白。4.通过对包被和标记工艺的摸索,成功地将所表达的抗原蛋白应用在HCV Ag/Ab联合检测试剂盒上。