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禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是正黏病毒科A型流感病毒属成员,能感染所有鸟类和大部分哺乳动物。根据HA和NA蛋白抗原性差异,AIV可分为18个HA亚型(H1~H18)和11个NA亚型(N1~N11)。水禽被认为是AIV的巨大天然储存库,几乎所有亚型AIV均能从水禽中分离到。对水禽中AIV携带情况调查结果表明,H6亚型AIV是分离率最高的低致病性AIV。最近的研究发现,人感染的H5N6亚型AIV主要是由H5N1和H6N6病毒发生基因重排引起的。因此加强对H6亚型AIV的监测和遗传变异分析具有重要的公共卫生学意义。本实验于2014年11月从表观健康三穗鸭泄殖腔分离鉴定得到一株H6N6亚型AIV,通过对其全基因组测序、遗传进化和致病性分析,旨在为家鸭中H6亚型AIV流行病学及遗传进化情况提供参考。1.H6N6亚型AIV分离鉴定及遗传进化分析:为了解贵州地区H6亚型AIV的流行情况和遗传进化特点,本研究采用鸡胚接种、血清学和RT-PCR方法从表观健康的三穗鸭泄殖腔分离鉴定得到一株H6N6亚型AIV(命名为A/duck/Guizhou/013/2014(H6N6),并对其进行部分生物学特性测定、全基因组测序与遗传进化分析。结果表明,分离株HA裂解位点是“339PQIETRG345”,为非连续碱性氨基酸,其MDT和ICPI分别为98.4 h和0.415,符合低致病性AIV的特征。BLAST结果显示分离株HA基因与A/chicken/Hunan/S41912/2009(H6N2)的核苷酸同源性最高(97.1%);NA基因与A/duck/Eastern China/48/2010(H6N6)的相似性最高(97.0%);而PB2基因与A/duck/Yamagata/061004/2014(H6N6)的同源性最高(96.9%),M基因与NP基因则分别与A/duck/Jiangsu/4/2010(H3N6)和A/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)同源性最高。以上研究结果表明,贵州省分离到的H6N6亚型AIV是一株弱毒株,其基因组可能是由H6N2、H3N6和H5N1等多个亚型病毒重组而成。2.鸭源H6N6亚型AIV对鸭致病性研究:为了解鸭源H6N6亚型AIV对麻鸭的致病性,将36只3周龄非免疫麻鸭随机分成两组:实验组以107.0EID50/0.1 mL的剂量通过滴鼻点眼方式接种病毒;对照组接种0.1 mL PBS。接种后分别于第1、3、5、7、9和11 d,采集咽喉和泄殖腔棉拭子,同时采集剖杀鸭的组织脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑、法氏囊、胸腺),通过荧光定量RT-PCR来检测病毒排毒和组织脏器中病毒含量。另外,取部分脏器用于病理组织学检查。试验结果表明,鸭感染分离株后不表现明显的临床症状,咽喉和泄殖腔未出现排毒现象。鸭感染后第3、5和7d在肺脏、脾脏、肝脏、脑、心脏均可以检测到病毒复制,除肺脏中第3 d病毒含量较高外,其它时间点的组织中病毒含量均不高。另外,病理组织学观察发现,在肺脏中可见少量炎性细胞浸润,其它组织无明显的病理变化。以上试验结果表明分离的H6N6亚型AIV对鸭的致病力弱,且在鸭体内的复制能力低。3.鸭源H6N6亚型AIV对免疫器官中细胞因子转录水平的影响:为了解鸭感H6N6亚型AIV后对免疫器官中IL-2、IL-10和IFN-α转录水平的影响,本试验通过荧光定量RT-PCR来检测鸭感染病毒后免疫器官(胸腺、脾脏、法氏囊)中IL-2、IL-10和IFN-αmRNA表达动态变化。结果显示,本试验建立的相对荧光定量RT-PCR方法可以用于检测鸭IL-2、IL-10和IFN-αmRNA的转录水平。鸭感染H6N6后免疫器官中的IL-2、IL-10和IFN-α呈现不同程度的转录水平变化,不同的细胞因子在不同组织之间的转录水平差异较大。其中IL-2在法氏囊中的转录水平比在胸腺和脾脏中明显较高;IFN-α在胸腺和脾脏中的转录水平高于法氏囊;IL-10在免疫器官中转录水平较低。试验结果表明H6N6亚型AIV对鸭免疫器官中IL-2、IL-10和IFN-α转录水平有一定的影响。综上所述:本试验分离到一株低致病性H6N6亚型AIV,该病毒可能是由H6N2、H3N6和H5N1等多个亚型AIV重组而成;鸭感染分离株后无明显临床症状和病理组织学变化,喉头和泄殖腔不存在排毒现象;分离株对鸭免疫器官损伤轻微,并且对免疫器官中IL-2、IL-10和IFN-α转录水平有影响。