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纳豆激酶(Nattokinase)是从日本传统食品纳豆中发现的一种分子量约为28kDa的碱性丝氨酸蛋白酶,由纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)发酵大豆中的蛋白质而得来。纳豆激酶有良好的溶解血栓活性,口服即可发挥良好功效且安全无毒副作用,具有巨大的应用开发前景。然而截至目前,纳豆激酶的规模化生产仍依赖于传统的固态发酵工艺,成本高、效率低;同时,纳豆激酶作为一种活性蛋白质如何通过胃肠消化而进入血液的相关机制并不明确。本研究主要围绕纳豆激酶的液态深层发酵优化以及通过在体外构建小肠上皮细胞吸收模拟模型来研究纳豆激酶的消化吸收过程而展开工作。本研究以纳豆激酶酶活作为指标通过多层次优化确定了纳豆激酶液态发酵的培养基与最佳培养条件。首先通过单因素试验确定了最适碳氮源分别为蔗糖和豆粉,并明确了三组添加剂甘油、CaCl2、MgC12的最适浓度;然后通过Plackett-Burman试验筛选出对纳豆激酶酶活影响最为显著的三个因子分别为磷酸氢二钾、培养温度以及培养时间;三个显著因子经Box-Behnken试验得出最优值。最终确定的液态发酵培养基配方与培养条件为豆粉12g/L、蔗糖24/L、甘油 4g/L、CaCl2 0.2g/L、MgCl2 0.3g/L、KH2PO4 2.3g/L、K2HPO4 14.109g/L、培养温度31.063℃、培养时间37.479h。纳豆激酶液态发酵培养液经超滤与冷冻干燥后所得的纳豆激酶冻干粉NK经过LC-MS/MS检测,与UniProt蛋白数据库进行比对能够确认纳豆激酶的存在,分子量为27.74kDa。构建静态体外模拟消化模型对NK进行胃部与小肠的模拟消化试验,经过1.5h的模拟消化反应得出结论,纳豆激酶能够很好的在小肠环境中保持自身状态,而无法耐受酸性较大的胃部环境。通过Caco-2细胞构建小肠上皮细胞吸收模型,通过形态学观察、跨膜电阻值(TEER)、标志物渗漏检测三项验证完成建模。AP侧上样NK后,经过2h后可在BL侧检测到纳豆激酶,证明纳豆激酶能够穿过小肠上皮细胞而被人体吸收。