马尾松速生、耐干旱瘠薄、适应性强,是我国南方荒山造林的先锋树种,造林面积居针叶树之首,主要用于制浆造纸、建筑、采脂等,在我国速生丰产材用和脂用林基地建设中占据极其重要的地位。松材线虫病是由松材线虫引发的一种特大毁灭性的森林病害,主要传播媒介为松墨天牛。松材线虫病蔓延速度快,防治难度大,严重危害着森林生态安全,并给林业带来巨大的经济损失。马尾松为松材线虫的主要危害对象之一,目前松材线虫病已严重阻碍了马尾松产业的发展。马尾松群体中存在抗松材线虫病的基因型,因此利用抗病品种替代易感品种是防治松材线虫病最为经济、有效的途径之一。前期课题组已在安徽、浙江等地选育部分抗性较高的马尾松家系和无性系,发现松脂产量和部分松脂化学组分含量与马尾松的抗性显著相关,并基于对高抗和易感马尾松基因型进行转录组高通量测序,筛选出一批抗松材线虫病候选基因。本研究在此基础上,以高抗马尾松和易感马尾松无性系作为试验材料,重点对抗松材线虫病候选基因中的4个萜类基因（抗性萜类基因）PmGPPS1、PmTPS4、PmTPS21和PmCYP720B11v2进行基因克隆、表达模式检测和功能验证,为揭示马尾松抗性机理和抗性品种早期选择奠定理论基础。主要结果如下:（1）马尾松PmGPPS1、PmTPS1、PmTPS4、PmTPS21和PmCYP720B11v2在马高抗与易感马尾松转录组中差异表达,因此结合马尾松全长转录组其所在基因家族进行全面鉴定。马尾松全长转录组中鉴定得到11个Pm IPS基因家族成员、54个PmTPS基因家族成员和14个PmCYP720B基因家族成员。通过构建系统进化树,Pm IPS基因家族成员分为IPS-a、IPS-b和IPS-d 3个亚家族,共有20个保守基序。PmGPPS和Pm GGPPS家族成员中共有的保守基序较多,抗病候选基因PmGPPS1位于IPS-b亚家族,可能参与GPP合成。PmTPS基因序列中单萜、倍半萜和二萜合酶分别位于TPS-d1、TPS-d2和TPS-d3三个进化枝。抗病候选基因PmTPS1和PmTPS4为TPS-d1成员,可能参与单萜合成;PmTPS21为TPS-d2成员可能参与倍半萜合成。PmCYP720B基因家族成员划分为4个进化枝,共有20个保守基序。进化枝Ⅰ和Ⅲ涵盖PmCYP720B成员较多,候选基因PmCYP720B11v2位于进化枝Ⅰ,可能参与多种二萜树脂酸合成。马尾松IPS、TPS和CYP720B基因家族中不同的亚家族成员的保守基序高度保守,同时各亚家族也含有其本身的特异性保守基序,进化关系近的成员,其保守基序也相近。（2）马尾松抗松材线虫病萜类合成关键基因在高抗马尾松树脂道上皮细胞特异性高表达。通过分析抗病候选基因在松材线虫胁迫下的表达模式,发现高抗马尾松PmGPPS1、PmTPS1、PmTPS4、PmTPS21和PmCYP720B11v2的表达量在接种后1 d、15 d、30 d皆显著高于易感马尾松。不同组织表达模式分析表明,接种后PmGPPS1、PmTPS1、PmTPS4、PmTPS21和PmCYP720B11v2在高抗马尾松茎部组织显著高表达。利用免疫组化方法,将PmGPPS1、PmTPS4、PmTPS21和PmCYP720B11v2特异性抗体与高抗马尾松的茎组织石蜡切片进行杂交,从蛋白水平分析候选基因在高抗马尾松中的组织定位。结果显示,抗性萜类基因的特异性抗体在高抗马尾松的木质部、形成层和韧皮部均有特异性表达信号,且在木质部的树脂道上皮细胞中的表达信号最强。（3）马尾松抗松材线虫病候选基因PmGPPS1促进单萜和二萜类化合物积累为松脂参与松材线虫胁迫提供合成前体。与野生型相比,烟草转基因株系中PmGPPS1表达量明显上调,PmGPPS1的过表达可以有效促进MVA和MEP途径关键基因的表达,结合MEP途径关键基因DXS和DXR以及MVA途径关键基因HMGS和HMGR的表达量结果发现,过表达PmGPPS1烟草中Nb HMGS、Nb HMGR、Nb DXS、Nb DXR和Nb GGPPS3基因表达量分别增加2.4、2.8、8.4、2.4和4.8倍。据此表明,过表达PmGPPS1可通过反馈调节机制激活MEP和MVA通路的代谢通量,从而显著提高过表达PmGPPS1烟草株系中D-柠檬烯和桉叶油醇的产量。D-柠檬烯、桉叶油醇可作为抑菌剂,因此推测PmGPPS1在抗松材线虫病过程中起正调控作用。另外,过表达PmGPPS1烟草株系可促进烟草二萜GA3和ZA含量增加,从而促进烟草生长发育,使花期提前、叶片增大、开花结实率增加,同时促进营养生长和生殖生长。（4）利用抗性萜类基因酶活产物对松材线虫进行体外培养,证实PmTPS4和PmTPS21酶活产物可抑制松材线虫活性。酶活检测结果表明,PmTPS4是一种多产物的α-蒎烯合酶,可以同时合成α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯4种单萜化合物。PmTPS21在以FPP为唯一底物情况下,可同时合成倍半萜（长叶烯）和单萜（α-蒎烯）,也可催化GPP合成单萜（α-蒎烯）,是一种具有双功能的长叶烯合酶。烟草瞬时转化结果与其酶活检测结果基本一致。以PmTPS4和PmTPS21的酶活产物以及马尾松松脂化学组分的萜类化合物的组成和含量为参考,设置α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、D-柠檬烯和长叶烯的不同浓度梯度的稀释液外源施加于体外培养的松材线虫,结果表明,在α-蒎烯、D-柠檬烯、长叶烯和β-月桂烯的单一溶液中,随着化合物浓度和处理时间的增加,松材线虫活性显著被抑制。其中,D-柠檬烯对松材线虫的抑制作用最明显。萜类化合物混合溶液对松材线虫的抑制作用显著高于单一溶液。低浓度的混合溶液处理6 h后,松材线虫存活率几乎为零。因此初步得出结论,作为马尾松PmTPS4和PmTPS21主要酶活产物同时作为马尾松松脂的主要成分,α-蒎烯、β蒎烯、β-月桂烯、D-柠檬烯和长叶烯可能马尾松对松材线虫的防御过程起重要作用。（5）PmCYP720B11v2可促进二萜树脂酸（DRAs）化合物积累从而提高马尾松抗性。利用同源重组的方法构建原核表达载体p ET28a-PmCYP720B11v2,对大肠杆菌中获得的重组蛋白大量表达,以13-羟基-8（4）-枞烯为底物,进行酶促反应。结果表明,PmCYP720B11v2可催化13-羟基-8（14）-枞烯生成3种二萜树脂酸:左旋海松酸、枞酸和新枞酸。据此得出结论,PmCYP720B11v2表现出催化活性,具有生化功能,可生成左旋海松酸、枞酸和新枞酸。左旋海松酸、枞酸和新枞酸均属于DRAs,在空气中易氧化、凝固,对松材线虫的入侵形成物理阻碍,结合高抗马尾松中PmCYP720B11v2表达量高于易感马尾松,因此认为PmCYP720B11v2在马尾松对松材线虫病的防御过程中起重要作用。