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目的: 乙型肝炎在全世界广泛流行每年至少有一百万人死于此病,同时也是影响我国全体国民身体健康最大的疾病之一。乙型肝炎病毒感染是导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌的主要致病因素之一。白介素32(IL-32)是一种促炎细胞因子,能诱导免疫细胞(单核细胞和巨噬细胞)分泌炎性细胞因子,如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-6的分泌。本研究致力于研究乙型肝炎病毒感染过程当中与白细胞介素-32(白介素-32,IL-32)的相互关系及其相关性,旨在阐明IL-32被乙型肝炎病毒诱导表达水平的变化情况,并进一步证实这一炎症因子在乙型肝炎病毒感染过程中发挥重要作用。 方法: 一、乙型肝炎患者外周血、细胞及组织中IL-32的检测 1.通过ELISA实验以64例乙型肝炎病毒感染者为实验组,其血清按照不同病毒量进行分组,分为高病毒量、中病毒量、低病毒量三组,检测被感染者的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)及IL-32在血清中的含量;同时以40例健康人为对照组,检测其丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)及IL-32在血清中的含量,利用统计学方法对乙型肝炎患者IL-32的结果与健康人的结果进行比较并统计分析; 2.通过外周血单个核细胞提取技术分别提取72例乙型肝炎病毒感染者的PBMC和40例健康人的PBMC,以72例乙型肝炎病毒感染者为实验组将患者的样本按照不同病毒量进行分组,分为高病毒量、中病毒量、低病毒量三组,检测单个核细胞中IL-32的mRNA含量,以40例健康人为对照组,检测单个核细胞中IL-32的mRNA含量,利用统计学方法对乙型肝炎患者外周血单个核细胞IL-32的mRNA含量结果与健康人的外周血单个核细胞IL-32的mRNA含量结果进行统计分析; 3.通过免疫组织化学染色技术对23例肝脏部分切除患者的肝脏组织进行染色,利用显微镜,观察镜下肝脏组织中IL-32化学染色情况,并拍照进行比较分析; 二、HepG2细胞模型中IL-32的检测 1.通过细胞培养技术,将HepG2肝细胞系细胞在体外进行培养,分别使用乙型肝炎病毒含量不同的患者血清和健康人血清对细胞进行刺激,将无血清刺激组作为对照组,有血清刺激组作为实验组,采用ELISA实验方法检测培养上清液中IL-32的含量,用统计学方法对实验结果数据进行统计分析; 2.通过细胞培养技术,将HepG2肝细胞系细胞进行体外培养,分别使用乙型肝炎病毒含量不同的患者血清和健康人血清对细胞进行刺激,将无血清刺激组作为对照组,有血清刺激组作为实验组,用RT-PCR技术检测细胞中IL-32mRNA表达情况,将结果进行统计分析; 3.通过细胞培养技术和免疫组织化学染色技术,分别使用乙型肝炎病毒含量不同的患者血清和健康人血清对细胞进行刺激,将无血清刺激组作为对照组,有血清刺激组作为实验组,将细胞进行固定、石蜡包埋后组织切片进行IL-32免疫组织化学染色,观察不同病毒含量的血清进行刺激后细胞中IL-32的表达情况,利用显微镜观察镜下肝脏组织中IL-32化学染色情况,并拍照进行比较分析; 结果: 一、乙型肝炎患者外周血及组织中IL-32的检测 1.血清IL-32 ELISA检测结果表明,实验组乙型肝炎感染患者病毒含量高、中、低组IL-32的含量与健康人对照组有明显差异(p<0.05),同时我们发现高病毒含量组的IL-32与中、低病毒含量组都有明显差异(p<0.05); 2.外周血PBMC中IL-32 mRNA含量检测表明,实验组乙型肝炎感染患者病毒含量中、低组IL-32 mRNA的含量与健康人对照组有明显差异(p<0.05),同时我们发现高病毒含量组的IL-32 mRNA的含量与中、低病毒含量组都有明显差异(p<0.05); 3.IL-32免疫组织化学染色结果表明23例临床肝脏组织切片中,炎症组织中IL-32明显着色,IL-32表达明显增高而正常组织中着色较浅; 二、HepG2细胞模型中IL-32的检测 1.HepG2细胞乙肝病毒不同病毒量刺激组和阴性血清刺激ELISA结果表明,高、中、低病毒含量刺激的细胞培养上清液中的IL-32与阴性血清刺激组比较有明显差异(p<0.05),高病毒含量组与中、低病毒含量组比较都有明显差异(p<0.05),对照组与实验组均存在显著差异(p<0.05); 2.HepG2细胞经过乙肝病毒不同病毒量刺激组和阴性血清刺激组IL-32mRNA的结果表明,高、中、低病毒含量刺激的细胞中的IL-32mRNA与阴性血清刺激组比较有明显差异(p<0.05),实验组与对照组也存在明显差异(p<0.05); 3.HepG2细胞经过乙肝病毒不同病毒量刺激组和阴性血清刺激组,IL-32免疫组织化学染色结果表明,高病毒刺激组与未受血清刺激组着色基本无差异,而与中、低病毒含量及阴性血清刺激组着色存在明显差异; 结论: 1.在乙型肝炎在活动期时随着HBVDNA含量的不同,IL-32在血清中含量降低,其中病毒含量较高时降低更为显著,外周血PBMC中IL-32mRNA的含量在高病毒含量组降低,而在中、低含量时升高,在受到炎症侵润的肝脏组织IL-32表达较为明显; 2.HepG2细胞在受到HBV病毒刺激后,高病毒刺激组上清液中IL-32含量低于阴性血清刺激组及未受刺激组,而中、低病毒刺激组IL-32含量高于阴性血清刺激组,细胞内IL-32 mRNA含量也如此,并且免疫组织化学显示高病毒含量刺激组IL-32表达量较低,在中低病毒刺激组IL-32表达较高。