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研究背景骨肉瘤属于原发于骨质的恶性肿瘤的一种,好发于青少年人群,死亡率高。尽管采取手术,辅助化疗和放疗等治疗策略,但骨肉瘤病人的5年生存率仍很低。因此,寻找参与肿瘤发展的新分子可以为骨肉瘤患者的诊治提供新策略。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一类产生于RNA前体的反向剪接过程的不含5’端帽和3’ polyA尾结构的RNA。多种生命体中均可检测到稳定存在的circRNAs,并可通过miRNA调控下游mRNA表达,在癌症进展中发挥着重要作用,已成为当前的研究热点。Ras相关的C3肉毒素底物1（Rac1）,属于RHO GTPases家族成员,研究报道其在多种恶性肿瘤中普遍上调,且Rac1的激活与肿瘤增殖和转移密切相关。我们前期预实验发现,hsa-circ0006602在骨肉瘤癌组织中表达上调,并可能通过circRNA-miRNA-mRNA网络调控参与骨肉瘤的进展。本课题拟通过实验研究探讨hsacirc0006602/miR-224/Rac1调控轴对骨肉瘤细胞生物学行为的影响。研究目的本实验拟对骨肉瘤组织及其癌旁组织进行高通量测序筛选出差异表达的hsacirc0006602,并研究其对骨肉瘤细胞MG63增殖、侵袭和迁移及成瘤能力的影响,同时通过生物信息软件预测筛选hsacirc0006602可能吸附的miRNA及miRNA靶向结合的基因,探讨其相互作用途径,阐明hsa-circ0006602/miR-224/Rac1调节轴在骨肉瘤细胞中调控作用的分子机制。以期为circRNA参与调控骨肉瘤进展的复杂机制提供新的理论依据及临床骨肉瘤防治提供新的靶点和策略。研究方法1.根据骨肉瘤及其癌旁组织高通量测序筛选出差异表达的circRNAs（如hsacirc0006602）,设计 Convergent Primer 和 Divergent Primer 分别以骨肉瘤细胞gDNA和cDNA为模板扩增,进行结构鉴定和测序验证hsacirc0006602在骨肉瘤细胞中是否存在。2.采用生物信息学软件Circular RNA Interactome数据库预测分析可能与hsacirc0006602 海绵结合的 miRNAs（如 miR-224）;TargetScan 和 miRBase等生物信息学软件预测miRNA靶基因（如Rac1）。3.qRT-PCR检测30例患者骨肉瘤和相应癌旁组织及骨肉瘤细胞系（MG63、SAOS-2、U20S）和正常成骨细胞 hFOB1.19 中 hsacirc0006602、miR-224 和Rac1 mRNA表达;Western blot检测Rac1蛋白表达。4.检测敲低hsacirc0006602对骨肉瘤MG63细胞生物学功能的影响。（1）分组:si-circ 组即 hsacirc0006602 敲低组（转染 hsacirc0006602 siRNA）;si-NC 组（转染 hsacirc0006602 negative control）;Blank 组（只加转染试剂）。（2）qRT-PCR检测细胞转染效率及miR-224和Rac1 mRNA表达,Western blot检测转染细胞中Rac1蛋白表达。（3）CCK-8、Transwel1、划痕实验分别检测各组细胞增殖、侵袭和迁移能力。5.检测过表达miR-224对MG63细胞中Rac1表达的影响。（1）分组:miR-224 mimics 组（转染 miR-224 mimics）;miR-NC 组（转染 miR-224 negative control）;Blank组（只加转染试剂）。（2）qRT-PCR检测转染效率。（3）qRT-PCR和Western blot检测转染细胞中Rac1表达。6.分别构建pmirGLO-circ6602和pmirGLO-Rac1野生型和突变型重组载体,双荧光素酶报告实验分别验证hsacirc0006602与miR-224及Rac1与miR-224的匹配结合作用。7.回复实验验证hsacirc0006602可通过Rac1对骨肉瘤恶性生物学行为产生影响。（1）分组:si-circ+Rac1 组（共转染 hsacirc0006602 siRNA 和pcDNA3.1-Rac1）;si-circ 组（仅转染 hsacirc0006602 siRNA）;Blank 组（只加转染试剂）。（2）CCK-8、Transwel1、划痕实验检测各组细胞增殖、侵袭和迁移。8.回复实验验证hsacirc0006602对Rac1的调节依赖于miR-224。（1）分组:si-circ+miR-224-in 组（共转染 hsacirc0006602 siRNA 和 miR-224 inhibitor）;si-circ 组（仅转染hsacirc0006602 siRNA）;Blank组（只加转染试剂）。（2）qRT-PCR和Western blot检测转染细胞中Rac1表达。9.裸鼠成瘤实验:用hsacirc0006602 siRNA慢病毒滴液感染骨肉瘤细胞MG63,嘌呤霉素筛选得到稳转hsacirc0006602 siRNA细胞,将其接种于裸鼠皮下。定期测量成瘤组织体积、重量并记录;免疫组化检测成瘤组织ki-67蛋白变化;qRT-PCR 检测瘤组织中 hsacirc0006602、miR-224 和 Rac1 mRNA 表达;Western blot检测Rac1蛋白表达。研究结果1.通过高通量测序及验证筛选发现,hsa circ0006602在骨肉瘤组织及其癌旁组织中明显差异表达（log2FC=5.4P=1.83E-10）,选定hsacirc0006602作为研究对象。hsacirc0006602的引物扩增及Sanger测序结果显示:只在cDNA中以Divergent Primer扩增能检测到hsacirc0006602对应大小条带,PCR扩增产物测序得到BackSplice Junction,表明hsacirc0006602在骨肉瘤细胞中真实存在。2.qRT-PCR检测骨肉瘤患者组织及骨肉瘤细胞系（MG63、SAOS-2、U2OS）结果显示:与相应癌旁组织及正常人成骨细胞hFOB1.19比较,在骨肉瘤组织和细胞系中hsacirc0006602和Rac1表达上调（P<0.05）、miR-224表达下调（P<0.05）。3.转染 hsacirc0006602 siRNA 的 MG63 细胞检测结果:（1）与 Blank 组比较,转染si-circ组细胞中hsacirc0006602表达显著下降（P<0.05）,而转染si-NC组hsacirc0006602表达水平无显著变化,表明MG63细胞转染成功。（2）与 Blank 组和 si-NC 组比较,si-circ 组中 miR-224 表达升高（P<0.05）,Rac1 mRNA和蛋白表达均下调（P<0.05）。提示敲低hsacirc0006602可促使miR-224表达升高,Rac1表达下降。（3）CCK-8、Transwel1及划痕实验显示,与Blank组和si-NC组比较,si-circ组MG63细胞的增殖活性显著受到抑制（P<0.05）,细胞侵袭和迁移能力降低（P<0.05）。表明敲低hsacirc0006602可抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力。4.转染miR-224 mimics的MG63细胞检测结果:（1）与Blank组比较,转染miR-224 mimics组细胞中miR-224的表达显著上升（P<0.05）,而转染miR-224-NC组的miR-224表达水平无显著变化,表明MG63细胞转染成功。（2）qRT-PCR 和 Western Blot 显示,与 Blank 组及 miR-224-NC 组比较,转染 miR-224 mimics组细胞中Rac1的mRNA和蛋白表达降低（P<0.05）,表明上调miR-224可抑制其靶基因Rac1表达,与下调hsacirc0006602结果趋势一致。5.生物信息学软件分析及双荧光素酶报告结果实验显示:hsacirc0006602与miR-224及Rac1与miR-224之间存在结合位点。hsacirc0006602可与miR-224结合,从而下调其表达,miR-224可靶向结合Rac1 3’UTR区域,负向调控其表达。提示在MG63细胞中可能存在hsacirc0006602/miR-224/Rac1调节轴关系。6.回复实验显示:敲低hsacirc0006602引起的Rac1表达降低可被miR-224 inhibitor部分回复（P<0.05）。提示hsacirc0006602对Rac1的调节作用依赖于miR-224。CCK8、Transwell 和划痕实验显示,在敲低 hsacirc0006602 细胞中,过表达Rac1可部分回复hsacirc0006602对MG63细胞增殖、侵袭和迁移能力的促进作用（P<0.05）。提示hsacirc0006602对骨肉瘤恶性生物学行为的影响依赖于Rac1分子。也进一步表明骨肉瘤细胞中hsacirc0006602/miR-224/Rac1调节轴的作用。7.裸鼠皮下成瘤实验显示:与阴性对照组比较,在敲低hsacirc0006602组的成瘤组织中,肿瘤体积、质量与生长速度明显降低（P<0.05）、ki-67蛋白表达降低（P<0.05）、hsacirc0006602 和 Rac1 的表达均降低（P<0.05）,而miR-224的表达高于对照组（P<0.05）。体内实验结果与体外细胞实验趋势一致。结论1.骨肉瘤组织及骨肉瘤细胞系中hsacirc0006602和Rac1高表达,miR-224低表达。2.hsacirc0006602 可结合 miR-224,而 miR-224 靶向结合 Rac1 3’ UTR,抑制其表达。3.下调hsacirc0006602或过表达miR-224,MG63细胞中Rac1表达均降低。同时,敲低hsacirc0006602的MG63细胞增殖、侵袭、迁移及裸鼠皮下成瘤能力均减弱。4.回复实验进一步验证了 hsa circ0006602通过miR-224/Rac1调节轴调控骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移。