论文部分内容阅读
目的:胃癌的转移复发是其发生和演进过程中最危险阶段。随着人们对胃癌转移规律的深入了解,并由此开展胃癌扩大性淋巴结清扫术、联合脏器切除术以来,术后淋巴结转移性复发和局部复发率有了较大程度的降低。但胃癌术后因腹膜遭癌细胞种植而复发的严重性却日渐突出,并成为治疗中最大障碍之一。文献报道在胃癌术后复发的类型中,腹膜种植约占50%,为导致多数患者死亡的主要原因,目前其发生机制尚不明确,且缺乏行之有效的防治手段。JAK-STAT(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription)是近来颇受关注的一条信号传导通路。研究发现STAT3的异常活化与乳腺癌、前列腺癌以及肺癌等多种恶性肿瘤发生发展密切相关,肿瘤细胞可能通过活化的STAT3信号影响肿瘤的发生发展进程,该信号传导途径与胃癌的相关性是最近为人们所认识的,但该信号途径是否也影响到胃癌腹膜种植这一关键性病理过程,又是通过何种方式调控哪些下游信号诱导胃癌细胞出现侵袭转移表型,其具体机制目前尚不清楚。为此,本课题首先观察胃癌患者腹水或腹腔冲洗液中细胞STAT3表达及其与胃癌临床病理参数及手术方式的关系,随后将STAT3诱饵寡核苷酸(decoy oligonucleotide)经脂质体介导转染胃腺癌细胞株MKN45,特异性抑制胞核内活化的p-STAT3蛋白,观察其阻抑效应;并最终建立胃癌裸鼠腹膜种植模型,观察胃癌细胞腹膜种植能力及腹膜种植转移过程相关调控因子的变化情况,由此力图揭示STAT3信号在胃癌腹膜种植过程的作用方式及机理,为胃癌腹膜种植转移防治提供新思路和实验依据。方法:(1)收集66例胃癌患者腹水或者腹腔冲洗液及12例胃良性疾病患者的腹腔冲洗液标本,应用腹腔冲洗细胞学检查其中的游离癌细胞,应用巢式RT-PCR方法检测腹腔冲洗液中CEA mRNA和STAT3 mRNA表达,系统分析并比较CEA mRNA、STAT3 mRNA表达与浆膜受侵、淋巴结转移、胃癌临床病理分期(TNM)、病理分化类型等病理因素以及采取的手术方式的相关性;(2)将特异性的STAT3 Decoy ODN转染胃腺癌MKN45细胞并予以鉴定,采用凝胶阻滞电泳(EMSA)和Western blot方法观察转染前后MKN45细胞中STAT3的DNA结合活性和磷酸化STAT3蛋白表达情况,明确STAT3受抑程度;(3)建立人胃癌细胞裸鼠腹膜移植模型,观察STAT3 Decoy ODN转染对胃癌细胞裸鼠腹膜种植转移能力的影响;同时观察转染后胃癌细胞在生长活力、粘附特性和体侵袭能力方面的改变情况;并应用流式细胞法、免疫组化方法检测各组细胞间E-cadherin、ICAM-1、CD44v6、MMP-2和MMP-9等蛋白表达的差异。结果:(1) PLC检测阳性率为31.8 %,巢式RT-PCR检测CEA mRNA和STAT3 mRNA阳性率分别为48.48%和43.94%。CEA mRNA及STAT3 mRNA的阳性检出率与PLC相比较有显著性差异(P = 0.000)。胃癌患者腹腔冲洗液CEA mRNA和STAT3 mRNA表达与肿瘤分化程度(P < 0.05)、浸润深度(P < 0.01)、淋巴结转移(P < 0.01)和TNM分期有关(P < 0.05),而与肿瘤的大小无关(P > 0.01);腹腔冲洗液中胃癌细胞STAT3 mRNA的表达与CEA mRNA表达呈现明显的正相关(r=0.999,P < 0.001)。比较开腹组与腔镜手术组标本CEA mRNA和STAT3 mRNA表达无显著性差异(P < 0.05)。(2) STAT3 Decoy ODN转染MKN45细胞后,细胞生长受到明显地抑制,抑制作用呈现时间依赖性;转染后细胞周期分布中,G0/G1期比例增高,而S期和G2/M期比例降低,细胞的增殖指数亦明显降低(P < 0.05)。胃癌细胞转染STAT3 Decoy ODN后,胞核内活化形态的p-STAT3蛋白表达与对照组相比无显著性差异(P > 0.05)。而STAT3的DNA结合能力与对照组相比有明显的差别。(3)建立各转染组胃癌细胞的裸鼠腹膜转移模型,STAT3 Decoy ODN转染组与对照组裸鼠比较,腹水产生时间、腹水量均有显著性差异(P<0.05);两组的腹膜种植瘤最大直径、最大重量和种植瘤数目相比,亦均有显著性差异(P < 0.05),Decoy ODN转染组肿瘤抑制率为42%;两组裸鼠的荷瘤生存时间、存活率、生命延长率相比有显著差异(P < 0.01或P < 0.05);种植瘤细胞周期分布情况:STAT3 Decoy ODN组与对照组细胞比较,G0/G1期比例增高,而S期和G2/M期比例降低,细胞的增殖指数降低。转染Decoy ODN后的胃癌MKN45细胞体外移行和侵袭能力均有不同程度降低(P < 0.05或P < 0.01)。转染Decoy ODN后的胃癌细胞中E-cadherin表达均显著高于对照组细胞中的相应值(P < 0.05),ICAM-1、CD44v6、MMP-2和MMP-9表达均显著低于对照组细胞中的相应值(P < 0.05或P < 0.01)。结论:①STAT3与胃癌腹膜种植行为关系密切,其表达水平可作为判断胃癌侵袭转移、术后复发情况及患者预后的参考指标之一;腹腔镜胃癌根治术式并不促进胃癌发生腹膜种植;②STAT3在胃癌细胞中的表达强度与其种植转移能力成正相关;③STAT3在细胞内作用受抑可导致胃癌细胞体内、外种植转移能力的降低;④根据本实验结果并参考文献分析,STAT3对胃癌细胞腹膜种植能力的影响主要是源于其诱导E-cadherin-catenin复合体异常表达以及促进ICAM-1、CD44v6、MMP-2和MMP-9蛋白合成等内在的分子生物学基础。