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为了研究镉胁迫对河南华溪蟹(Sinopotamon honanense)C型凝集素免疫应答的影响,本论文首先采用镉联合细菌胁迫的方式,通过半定量RT-PCR及实时荧光定量技术,从河南华溪蟹转录组测序结果中筛选出了对镉胁迫敏感的两种C型凝集素基因Sh Lec21和Sh Lec23。其次,克隆得到Sh Lec21和Sh Lec23 c DNA全长,并对其进行了同源性及系统进化分析。同时通过RT-PCR方法检测了Sh Lec21和Sh Lec23m RNA的组织分布情况,并进一步通过绝对定量方法检测了镉联合嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)胁迫后其在肝胰腺和血淋巴中的表达变化。最后,构建了携带有GST融合标签的两种C型凝集素Sh Lec21和Sh Lec23的重组原核表达质粒,表达和纯化了重组融合蛋白,并制备了两种C型凝集素的兔源多克隆抗体。另外,通过平板抑制实验检测了r Sh Lec21和r Sh Lec23的抗菌活性。研究结果如下:1.河南华溪蟹Sh Lec21和Sh Lec23基因的筛选根据河南华溪蟹转录组测序结果,采用半定量RT-PCR及实时荧光定量方法,通过检测不同浓度、不同时间镉联合嗜水气单胞菌胁迫后C型凝集素的表达变化,筛选出了响应镉胁迫的两种C型凝集素基因Sh Lec21和Sh Lec23。2.河南华溪蟹Sh Lec21与Sh Lec23的克隆及表达模式分析克隆得到两种河南华溪蟹C型凝集素基因Sh Lec21与Sh Lec23,其c DNA全长分别为863bp与681bp,各含459bp与495bp的开放阅读框,各编码152与164个氨基酸残基。Sh Lec21氨基酸序列与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的Es Lec G相似性高达65%,Sh Lec23氨基酸序列与三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的Pt LP相似性达48%,而Sh Lec21与Sh Lec23基因编码的氨基酸序列相似性仅为32%。Sh Lec21和Sh Lec23在血淋巴、鳃、肝胰腺、肠道、肌肉、卵巢及精巢七种被检测组织中广泛表达,Sh Lec21在肝胰腺、肠道和卵巢中表达量较高,Sh Lec23在肝胰腺中表达量较高。不同时间(0、1、4和7d)镉胁迫后,Sh Lec21与Sh Lec23 m RNA表达量在肝胰腺与血淋巴中没有明显变化;嗜水气单胞菌胁迫后,Sh Lec21与Sh Lec23 m RNA在肝胰腺中表达量均极显著性(p<0.01)下调,Sh Lec23 m RNA在血淋巴中表达量显著性(p<0.05)下调;而镉胁迫蟹体后再感染嗜水气单胞菌,肝胰腺与血淋巴Sh Lec21和Sh Lec23 m RNA表达量在一定时间与浓度镉处理组显著(p<0.05)或极显著(p<0.01)上调(Sh Lec21的不同浓度镉处理组除外)。3.河南华溪蟹Sh Lec21和Sh Lec23的原核表达、多克隆抗体制备及其抗菌活性携带有GST标签的重组融合蛋白r Sh Lec21和r Sh Lec23,在0.2mmol/L IPTG、28℃、150rpm条件下诱导10h,能够以包涵体形式被诱导表达,且通过包涵体复性与纯化,可得到纯化的r Sh Lec21和r Sh Lec23。利用纯化的重组融合蛋白作为抗原,分别制备得到了抗r Sh Lec21和r Sh Lec23兔源多克隆抗体,其效价均在1:100000以上。而通过平板抑制圈实验,r Sh Lec21和r Sh Lec23没有显示出对大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及毕赤酵母(Pichia pastoris)的抗菌活性,其原因还待进一步研究。由研究结果得出三个结论:1.Sh Lec21和Sh Lec23是对镉胁迫敏感的C型凝集素基因,可能在河南华溪蟹抵御镉胁迫的先天性免疫中发挥重要作用。本研究内容为镉胁迫下的河南华溪蟹C型凝集素先天性免疫研究奠定了基础。2.通过系统生物信息学分析及组织分布结果推测,Sh Lec21和Sh Lec23在河南华溪蟹先天性免疫中发挥了不同的功能。绝对定量结果表明,镉能够改变Sh Lec21和Sh Lec23响应嗜水气单胞菌感染的免疫应答,对河南华溪蟹先天性免疫具有调节作用。3.得到高效价的r Sh Lec21和r Sh Lec23多克隆抗体。平板抑制实验结果并不能说明Sh Lec21和Sh Lec23对大肠杆菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌及毕赤酵母没有抗菌活性。这可能是由于r Sh Lec21和r Sh Lec23携带的GST标签影响了两种C型凝集素的结构和功能,从而导致了阴性结果。Sh Lec21与Sh Lec23是否有抗菌活性还需要进一步的研究证明。总之,本文为深入研究Sh Lec21与Sh Lec23基因在河南华溪蟹先天性免疫中的功能提供理论基础和实践工具。