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BCR-ABL融合蛋白异常的酪氨酸激酶活性是慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia, CML）的主要致病因素。临床上的一线治疗药物伊马替尼通过抑制ABL激酶活性发挥疗效。然而，ABL激酶区的突变导致对伊马替尼耐药，因此，寻找ABL激酶区外的抑制靶点或直接清除BCR-ABL蛋白有可能克服伊马替尼耐药。BCR-ABL激酶区外的第177位酪氨酸（Y177）在 CML的发病中同样发挥着关键的作用，当Y177磷酸化后，可募集GRB2的SH2结构域，激活GRB2下游 RAS-MAPK和 PI3K-AKT信号通路。Y177磷酸化缺陷的突变体Y177F不能转化Rat-1成纤维细胞，致小鼠发病能力也显著下降。因此，去磷酸化Y177将阻断GRB2信号通路。PTP1B是蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）家族成员，PTP1B通过其催化结构域（PTP1B/C）对多种酪氨酸激酶发挥去磷酸化的作用。鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase, ODC）是经典的不需要泛素化而直接降解的蛋白，它与抗酶蛋白1（Antizyme1，AZ1）结合后经蛋白酶体降解。如果将BCR-ABL打上ODC标签，就能引导BCR-ABL经ODC-AZ1途径降解。综合以上分析，本课题提出以下研究思路，构建SH2-PTP1B/C-ODC（SPO）和 AZ1重组腺病毒，转导 CML细胞，PTP1B/C借SH2与BCR-ABL Y177的结合，将Y177去磷酸化，阻断Y177与GRB2的结合。同时，借SH2信号将BCR-ABL打上ODC标签，将BCR-ABL引入 ODC-AZ1非泛素化-蛋白酶体降解途径，达到抑制癌蛋白活性，促进癌蛋白降解的双重目的。本研究可为伊马替尼耐药患者的治疗提供一种新的思路。 本课题将从以下3个方面进行研究： 1. SPOA靶向BCR-ABL Y177去磷酸化和非泛素化降解：以K562细胞cDNA为模板，PCR扩增目的基因SH2、PTP1B/C、ODC和AZ1。克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV，与腺病毒骨架质粒pAdEasy1同源重组，在AD-293细胞中包装、扩增腺病毒，western blot鉴定目的蛋白的表达。SPOA腺病毒感染CML敏感和耐药细胞株，通过western blot实验检测野生或突变BCR-ABL的Y177磷酸化水平和总蛋白水平，以及正常c-ABL的活化和表达。 2. SPOA靶向杀伤CML敏感和耐药细胞及机制研究：SPOA腺病毒处理CML敏感和耐药细胞，通过MTT，克隆形成实验，瑞氏染色， DAPI染色和流式细胞术（FCM）检测SPOA对CML敏感和耐药细胞株效应的影响；同时，通过 MTT，克隆形成实验和 FCM检测 SPOA对 BCR-ABL阴性细胞效应的影响。免疫共沉淀实验检测 SPOA与BCR-ABL是否存在直接作用以及这种作用是否影响 BCR-ABL与GRB2的结合，western blot分析BCR-ABL下游信号STAT5，AKT， ERK和CRKL的活化。 3. SPOA抑制K562白血病细胞在小鼠体内的致病潜能：K562细胞经SPOA或null病毒预处理后，经尾静脉注入NOD-SCID小鼠体内，观察小鼠进食、毛色、活跃度等一般生存状态；比较两组小鼠发病率，发病时间，存活率和生存时间；计数外周血白细胞（WBC），瑞氏染色分析血象和骨髓象；FCM检测骨髓细胞人源CD45+细胞比例，western blot检测骨髓细胞BCR-ABL的表达；分析肝、脾外观大小及重量，HE染色分析CML细胞对肝、脾的浸润情况。 通过以上研究，得到以下主要结果或结论： 1.成功构建高滴度的SPOA重组腺病毒，目的蛋白在K562细胞中表达正确。SPO可将Y177去磷酸化，而不影响正常c-ABL激酶活性。SPOA可显著降低BCR-ABL蛋白的稳定性，促进BCR-ABL蛋白经ODC-AZ1非泛素化蛋白酶体途径降解，而不影响正常c-ABL的表达。SPOA对BCR-ABL的去磷酸化和降解效应不受BCR-ABL突变的影响。 2. SPOA可对CML敏感和耐药细胞株发挥抑增殖和促凋亡效应，而对BCR-ABL阴性细胞株的效应无影响。SPOA通过直接与BCR-ABL的相互作用，去磷酸化 Y177，同时促进 BCR-ABL蛋白降解，阻断BCR-ABL与GRB2的结合，减少BCR-ABL对STAT5，AKT，ERK和CRKL的活化，从而对CML细胞发挥抑增殖和促凋亡效应。 3. SPOA组小鼠外周血的最高WBC数低于null组，达最高WBC数的时间晚于 null组，骨髓、肝、脾等器官或组织白血病细胞浸润情况轻于null组， SPOA组小鼠的发病率低于null组，发病时间晚于null组，存活率高于null组，生存时间长于null组，证实SPOA降低了CML细胞在小鼠体内的增殖致病能力。