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神经菌毛素1（Neuropilin-1;NRP1）是一种多功能的非酪氨酸激酶受体，其最初作为轴突导向因子3(Semaphorin3，Sema3)的受体，在神经系统发育中具有调控神经元细胞的导向以及轴突生长的功能。进一步的研究发现，NRP1在血管内皮细胞以及多种肿瘤细胞表面高表达，是血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)的共受体。NRP1通过其胞外区b1b2结构域与VEGF165相结合，显著提高VEGF165与血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2，KDR)的结合能力，促进血管发育生成。肿瘤部位新生血管及肿瘤细胞表面高表达的NRP1，能显著促进肿瘤局部血管生成以及肿瘤生长、侵袭和转移。研究显示，阻断VEGF165与NRP1的结合，不仅能直接抑制肿瘤细胞的迁移，抑制移植瘤的形成，而且还能抑制肿瘤局部血管生成，间接抑制肿瘤的生长。由于NRP1在肿瘤发生发展中所起到的病理性促进作用，NRP1逐渐成为继VEGFR后的一个抗肿瘤治疗的新靶标。本研究通过基因工程技术克隆得到人NRP1 b1b2结构域(HuNRP1b1b2) cDNA，并对其进行表达并纯化，将获得的重组蛋白免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术筛选特异性针对人HuNRP1b1b2（HuNRP1b1b2）的单克隆抗体。该特异性单克隆抗体的获得将为抗血管生成及靶向抗肿瘤治疗提供良好的生物学材料。 一、人神经菌毛素1 b1b2区编码基因的克隆、表达 利用PCR技术获得HuNRP1b1b2编码基因，将该基因片段克隆到载体质粒pColdTM TF，获得重组质粒pColdTM TF-HuNRP1b1b2，双酶切鉴定和测序分析正确后，将重组质粒转化表达宿主菌BL21(DE3)，构建重组菌BL21(DE3)(pColdTM TF-HuNRP1b1b2)。16℃下，重组表达菌经不同浓度的IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析，确定IPTG的最佳诱导浓度。融合蛋白经Ni+柱亲和层析进行纯化，纯化后的蛋白经超滤、浓缩、截留、Buffer交换后获得浓缩的融合蛋白TF-NRP1b1b2。SDS-PAGE结果表明IPTG的最佳诱导浓度为0.4 mM/L，浓缩后的融合蛋白TF-NRP1b1b2浓度为1.0 mg/mL。 二、抗人神经菌毛素1 b1b2区单克隆抗体的制备及生物学特性分析 采用融合蛋白TF-HuNRP1b1b2及标签蛋白TF分别免疫8wk BALB/c小鼠，100 ug/只，共免疫3次，间隔2 wk。首免，将融合蛋白与等量完全弗氏佐剂混合乳化，采用腹部皮下多点注射免疫;二免，将融合蛋白与等量不完全弗氏佐剂混合乳化，采用腹部皮下多点免疫;加强免疫，尾静脉注射不加佐剂的融合蛋白。3d后，取鼠脾脏细胞与SP2/0-Ag-14进行细胞融合。采用间接ELISA及间接免疫荧光两种方法分别筛选阳性杂交瘤细胞。间接ELISA，以融合蛋白TF-HuNRP1 b1b2包板，筛选阳性杂交瘤细胞株;同时以TF标签蛋白包板，排除其中的假阳性。间接免疫荧光法，固定液固定膜表面高表达HuNRP1的MDA-MB-231细胞株，分别以融合蛋白TF-HuNRP1b1b2、标签蛋白TF免疫的小鼠血清作为阳性、阴性对照，建立间接免疫荧光法。经有限稀释法对阳性杂交瘤细胞株进行亚克隆，共获得五株能稳定分泌抗HuNRP1b1b2的单克隆抗体(McAbs)细胞株，分别命名为:3E10、5E9、1D12(间接ELISA)、1A7、4F11（间接免疫荧光）。采用间接ELISA、Western-blot、间接免疫荧光、流式细胞术等方法对腹水McAbs的生物学特异性进行分析。腹水McAbs3E10、5E9、1D12、1A7、4F11的ELISA效价分别为:1∶51200、1∶204800、1∶102400、1∶51200、1∶102400;Ig亚类分别为IgG2a、IgG2a、IgG3、IgM、IgM; Western-blot鉴定表明所得McAbs只与融合蛋白TF-HuNRP1b1b2相结合，而不与标签蛋白TF或其他菌体蛋白相结合;间接免疫荧光结果显示，McAbs1A7、4F11能与MDA-MB-231、HepG2及HUVEC细胞表面HuNRP1相结合，其它三株McAbs则不能;流式细胞术结果表明McAbs4F11在800倍稀释、McAbs1A7在400倍稀释时仍能与MDA-MB-231具有较高的亲和力。 三、抗人神经菌毛素1 b1b2区单克隆抗体的初步应用 采用transwell小室迁移实验，分析McAbs对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞的迁移影响;采用MTT法分析McAbs对HUVEC、HepG2、MDA-MB-231细胞的增殖影响;采matrigel诱导的HUVEC体外成管试验，分析McAbs对血管生成的影响。transwell小室迁移实验结果表明，McAbs1A7和4F11能有效抑制HUVEC的迁移;MTT实验结果显示McAbs1A7和4F11均能抑制HUVEC的增殖，但对HepG2、MDA-MB-231细胞增殖无显著影响;HUVEC细胞体外成管实验结果表明McAbs1A7及4F11能够抑制HUVEC细胞成管。 综上，本研究成功制备了重组蛋白HuNRP1b1b2，并以之为抗原，采用杂交瘤技术，以间接ELISA及间接免疫荧光法筛选，共获得五株能稳定分泌抗HuNRP1b1b2 McAbs的杂交瘤细胞株。McAbs均只特异性识别融合蛋白HuNRP1b1b2，其中McAbs1A7以及4F11均能识别天然HuNRP1，且能显著抑制HUVEC的迁移、增殖以及成管。该特异性的McAbs的获得将为深入进行HuNRP1以及抗肿瘤血管生成等方面的研究提供材料。