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本文拟利用TAT蛋白转导技术介导NEP1-40转导入脑组织。将NEP1-40克隆到pTAT-HA载体上，体外表达、纯化重组TAT-NEP1-40融合蛋白。然后，将纯化后的TAT-NEP1-40通过腹腔注射的方式给药，来检测融合蛋白TAT-NEP1-40对短暂性局脑缺血是否具有保护作用，用TAT-β-Gal蛋白作为对照。缺血模型采用大脑中动脉栓塞诱导缺血2h，两种蛋白均通过腹腔注射给缺血后的大鼠。再灌注24h时TTC法测定脑梗塞容积，TUNEL染色法检测TAT-NEP1-40对缺血后脑细胞的保护作用。
获得主要实验结果如下：
1)TAT-NEP1-40的克隆、表达和纯化利用PCR技术从KIAA0886中扩增编码Nogo-66氨基端40个氨基酸残基：RIYKGVIQAIQKSDEGHPFRAYLESEVAISEELVQKYSNS的序列，克隆到pTAT-HA载体上，测序证实序列无误。将质粒转化DE3(BL21)，IPTG诱导表达、Ni离子亲和柱纯化TAT-NEP1-40融合蛋白，SDS-PAGE分析鉴定融合蛋白的表达。结果表明TAT-NEP1-40在DE3中以包含体形式高表达；经纯化可以得到高纯度的融合蛋白。亲和纯化后的融合蛋白TAT-NEP1-40经透析法进行复性，复性后的蛋白经超滤浓缩后，BCA法测定蛋白浓度为170ug/mL。
2)TAT-NEP1-40的转导作用将TAT-NEP1-40加到PC12细胞培养液中，孵育60min，免疫荧光染色可以观察到TAT-NEP1-40进入细胞内。将TAT-NEP1-40腹腔注射SD大鼠融合蛋白6h后，灌注固定，冰冻切片，免疫组化染色，结果显示TAT融合蛋白可以在脑实质中广泛分布。
3)体外模拟缺血模型，TAT-NEP1-40保护PC12的缺氧损伤用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)合并缺糖模拟PC12细胞缺血模型，缺氧处理60min后加入融合蛋白TAT-NEP1-40孵育24h，经MTT法测定细胞活力和FCM检测凋亡细胞均显示融合蛋白对缺氧具有保护作用。
4)TAT-NEP1-40局部缺血后脑保护作用线栓塞法致大脑中动脉阻塞(MCAO)局脑缺血再灌流损伤模型。栓塞2h，再灌注24h。再灌注前腹腔注射融合蛋白。TTC染色，测脑梗死容积。结果显示TAT-NEP1-40融合蛋白可以减少脑梗死容积。
大鼠局脑缺血，腹腔注射融合蛋白。灌注固定，冰冻切片后TUNEL染色，与对照蛋白比较结果显示，TAT-NEP1-40融合蛋白可以明显减少凋亡细胞数量。
本研究结果将有助于进一步研究NEP1-40在神经再生和保护方面的功能和作用，为NEP1-40在在中枢神经系统的运用提供可行的、安全方便的方法。