研究背景:胃癌是世界上常见的恶性肿瘤之一,其预后较差,死亡率高。尽管近年来胃镜技术的发展大大提高了早期胃癌的诊断率并进一步改善了早期胃癌患者的生存率,但进展期胃癌患者仍缺乏有效的治疗手段,生存率仍较差。胃癌的浸润和转移是造成晚期胃癌患者复发及预后不良的主要原因。胃癌的浸润和转移是多阶段,多因素调控的复杂过程,其分子机制仍不是很清楚。深入探索胃癌浸润和转移的分子机制有助于提供有效的治疗靶点,并改善胃癌患者的预后。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸,缺乏可识别的开放阅读框(open reading frame,ORF),且不具有蛋白质编码能力的RNA分子。已有研究表明lncRNA在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用,其调控方式包括介导染色质重塑及组蛋白修饰、转录及转录后水平的调控等。虽然关于lncRNA的研究进展迅猛,但绝大部分lncRNA的功能仍然是不清楚的,与胃癌转移相关的lncRNA的报道更是少数。本研究通过胃癌组织lncRNA表达谱芯片筛选出与胃癌转移显著相关的lncRNA GCMA,随后在独立胃癌组织样本中检测GCMA的表达,并分析其与胃癌临床病理参数的关系,在转录水平上探索胃癌中GCMA异常表达的上游调控机制。通过体内外功能实验探索GCMA对胃癌细胞增殖、浸润和转移能力的影响,并通过寻找与其直接结合的miRNA及调控的下游靶基因,在lncRNA-miRNA-靶基因层面探究GCMA调控胃癌进展的分子机制。研究方法:本研究通过高通量lncRNA表达谱芯片筛选出与胃癌转移显著相关的lncRNA。使用实时定量PCR(RT-qPCR)检测胃癌组织样本及胃癌细胞系中GCMA的表达情况,进一步分析GCMA表达量与胃癌患者的年龄、性别、肿瘤大小,浸润深度,分化程度及淋巴结转移等临床病理参数之间的相关性。随后利用基因数据库进行GCMA精准基因学分析,确定其染色体定位、核苷酸长度及编码蛋白质的能力。利用荧光原位杂交(FISH)技术明确GCMA的细胞内定位并通过放线菌素D加药实验检测GCMA在胃癌细胞中的稳定性。为确定GCMA的核心启动子区,我们构建了 GCMA上游启动子区的截短质粒并进行了荧光素酶实验。使用生物信息学网站预测可能与GCMA核心启动子区结合的转录因子,并通过荧光素酶实验、RT-qPCR及染色质免疫共沉淀实验(ChIP实验)进一步验证转录因子对GCMA的调控作用。通过Transwell实验、MTS和EdU细胞增殖实验及细胞凋亡实验在体外条件下检测GCMA对胃癌细胞迁移、浸润、增殖及凋亡能力的影响。利用包装GCMA shRNA的慢病毒感染胃癌细胞,稳筛后构建GCMA稳定敲低的胃癌细胞株,并将其通过皮下和尾静脉注射到裸鼠体内,观察GCMA在体内条件下对胃癌细胞生长、浸润及转移能力的影响。使用生物信息学网站对GCMA可能结合的miRNA进行预测,通过RNA免疫共沉淀实验(RIP实验)及荧光素酶实验验证两者之间的结合作用。甲基化特异性PCR实验(MSP实验)用于检测胃癌细胞系及胃癌组织样本中miRNA启动子甲基化水平。利用生物信息学网站预测miRNA的靶基因,并通过荧光素酶实验及western-blot实验验证miRNA对靶基因的调控作用。免疫组织化学技术(IHC)用于检测miRNA的靶基因在胃癌组织中的表达情况。临床样本相关性分析、荧光素酶实验、体内外的挽救实验、以及western-blot实验进一步证实GCMA-miRNA-靶基因的ceRNA调控网络及下游分子机制对胃癌转移的调控作用。结果:(1)LncRNA GCMA是一种与胃癌转移相关的lncRNA通过高通量lncRNA表达谱芯片(GEO数据库:GSE72307)在5例发生淋巴结转移与5例未发生淋巴结转移的原发性胃癌组织中筛选出显著差异表达的lncRNA。芯片结果显示lncRNA GCMA在发生淋巴结转移的胃癌组织中显著上调。另外选取72例独立胃癌组织样本进行验证,RT-qPCR结果显示GCMA在发生淋巴结转移的胃癌组织中的表达量显著高于未发生淋巴结转移的胃癌组织。此外,GCMA在胃癌细胞系中的表达水平显著高于人永生化胃黏膜细胞GES-1,且与胃癌细胞系的淋巴结转移状态相关。受试者工作特征曲线(ROC曲线)显示GCMA表达量可较好地区分胃癌组织是否发生淋巴结转移。临床病理参数相关性分析显示GCMA高表达与淋巴结转移显著相关,预后分析显示GCMA高表达的患者的总生存(OS)和无病生存(DFS)较差。Ensembl和NCBI基因数据库显示GCMA位于人的21号染色体长臂末端,是一种基因间lncRNA,全长2198个核苷酸。CPAT网站预测显示GCMA不具有编码蛋白质的能力。FISH实验显示GCMA定位于细胞质和细胞核中。放线菌素D加药实验表明GCMA在胃癌细胞中的稳定性较好。(2)转录因子SP1激活GCMA的转录为研究胃癌中GCMA异常表达的上游调控机制,通过Ensembl数据库查询GCMA的上游启动子区域并构建转录起始位点(TSS)上游-746bp、-515bp、-253bp、-125bp启动子区的截短荧光素酶质粒。荧光素酶实验显示GCMA核心启动子区位于上游-125bp到转录起始位点之间。PROMO和JASPAR网站预测结果显示SP1、E2F1、CEBP-β等多个转录因子可与GCMA核心启动子区结合,荧光素酶及突变实验、RT-qPCR及ChIP实验表明转录因子SP1可直接结合到GCMA核心启动子区,激活GCMA的转录并上调其在胃癌中的表达。(3)在体外条件下GCMA促进胃癌细胞的迁移、浸润和增殖能力RT-qPCR显示转染GCMA过表达质粒可显著上调胃癌细胞中GCMA的表达,而转染GCMA siRNA则显著抑制GCMA的表达。Tanswell结果表明过表达GCMA可显著促进胃癌细胞的迁移和浸润能力,而干扰GCMA则抑制胃癌细胞的迁移和浸润能力。MTS、EdU细胞增殖实验表明过表达GCMA后,胃癌细胞的增殖能力显著增加,而干扰GCMA后其增殖能力明显减弱。细胞凋亡实验表明GCMA对胃癌细胞的凋亡能力无显著影响。(4)在体内条件下GCMA促进胃癌细胞的浸润、转移和增殖能力为了探究GCMA在体内条件下对胃癌细胞生物学行为的影响,我们利用包装了 GCMA shRNA质粒的慢病毒(LV-shGCMA)感染胃癌细胞,利用嘌呤霉素稳筛后建立GCMA稳定敲低的胃癌细胞株。RT-qPCR结果显示,LV-shGCMA组中GCMA的表达量显著低于对照组。将GCMA稳定敲低的MKN45胃癌细胞通过尾静脉注射至裸鼠体内,观察GCMA对胃癌细胞远处转移能力的影响。活体成像及HE切片染色结果表明GCMA的敲低显著抑制了胃癌细胞的肺脏转移能力。将GCMA稳定敲低的MKN45细胞注射到裸鼠皮下,观察瘤体的生长状况及局部浸润情况。结果显示,与对照组相比,LV-shGCMA组的皮下瘤体生长较慢,瘤体的体积和重量较小,且无明显的局部浸润现象。(5)GCMA吸附miR-124和miR-34a,上调后者的靶基因slug和snail表达我们进一步探索了 GCMA促进胃癌进展的分子机制。通过GCMA shRNA将GCMA敲低后,FISH实验显示胞质中的GCMA显著减少,而胞核中的GCMA无明显变化,提示胞质中的GCMA可能参与了胃癌中原癌/抑癌基因的转录后调控。RIP实验结果表明Ago2抗体可显著富集GCMA,提示Ago2蛋白可能介导了胞质中GCMA与miRNA的相互作用。Segallab和RegRNA网站预测结果显示GCMA可与多个miRNA结合。结合两个网站的交集和相关文献,我们挑选了19个具有抑癌作用并在肿瘤中低表达的miRNA进行下一步的验证。荧光素酶及突变实验结果表明miR-124和miR-34a分别与GCMA不同位点结合。甲基化特异性PCR(MSP)实验结果发现miR-124和miR-34a启动子在胃癌细胞系及组织中存在部分甲基化,提示miR-124和miR-34a在胃癌中是不完全表观遗传沉默,进而可能被GCMA所吸附。我们使用Targetscan和miRanda网站预测miR-124和miR-34a的靶基因,结合GCMA促进胃癌浸润和转移的功能及miRNA靶基因的相关文献,筛选出slug和snail分别作为miR-124和miR-34a的靶基因。荧光素酶及突变实验、western-blot实验结果表明miR-124和miR-34a可分别结合到slug mRNA和snail mRNA的3’UTR,从而抑制slug和snail蛋白的表达。荧光素酶和western-blot的挽救实验显示GCMA可作为ceRNA竞争性吸附miR-124和miR-34a,解除它们对slug和snail的抑制作用,从而上调slug和snail在胃癌中的表达。此外,我们还在胃癌组织样本中验证了三者之间的相关性,结果显示miR-124和miR-34a表达量与GCMA表达量呈显著负相关,slug和snail蛋白表达水平分别与miR-124和miR-34a表达量呈显著负相关,而slug和snail蛋白表达水平与GCMA表达量呈显著正相关。(6)在体内外条件下,lncRNA GCMA作为竞争性内源性RNA(ceRNA)促进胃癌进展体外 Transwell、MTS、EdU 的挽救实验结果显示,inhibitor-124 和 inhibitor-34a显著逆转了 shGCMA对胃癌细胞迁移、浸润及增殖能力的抑制作用,而转染inhibitor-124+shSlug和inhibitor-34a+shSnail后胃癌细胞的迁移、浸润及增殖等生物学行为再次受到抑制。体内动物实验结果显示瘤体内注射antagomir-124和antagomir-34a能够显著逆转shGCMA对瘤体生长的抑制作用,瘤体的生长得以恢复,而注射antagomir-124+shSlug和antagomir-34a+shSnail则使瘤体的生长再次被抑制。通过western-blot进一步瘤体内检测了 slug和snail的蛋白水平,结果显示瘤体内注射antagomir-124和antagomir-34a可分别逆转shGCMA对瘤体slug和 snail 蛋白的抑制作用,而注射 antagomir-124+shSlug 和 antagomir-34a+shSnail分别使瘤体内slug和snail的蛋白表达再次被抑制。以上结果证实miR-124和slug、miR-34a和snail共同介导了 GCMA对胃癌细胞迁移、浸润及增殖能力的调控作用。(7)GCMA作为ceRNA促进胃癌的上皮间质转化(EMT)过程在胃癌细胞中转染GCMA过表达质粒后48h,细胞形态发生向长梭形间质细胞形态的转变。Western-blot实验结果表明GCMA可抑制上皮标志物ZO-1和E-cadherin的表达,促进间质标志物β-catenin和vimentin的表达,从而促进EMT过程。相反,敲低GCMA后,ZO-1和E-cadherin的表达上调,β-catenin和vimentin的表达下调,胃癌细胞的EMT过程被抑制。随后western-blot的挽救实验证实GCMA可显著逆转miR-124和miR-34a对胃癌细胞EMT过程的抑制作用,促进EMT过程,而slug和snail的敲低再次抑制了这一过程。同样,挽救性抑制miR-124和miR-34a解除了 GCMA敲低对胃癌EMT过程的抑制作用,而敲低slug和snail之后胃癌的EMT过程再次受到抑制。此外,我们还在动物瘤体内验证了 GCMA对胃癌细胞EMT过程的调控作用,结果显示,与对照组相比,LV-shGCMA组ZO-1和E-cadherin的表达显著上调,而β-catenin和vimentin的表达显著下调,EMT过程显著抑制。以上结果显示GCMA-miR-124-slug和GCMA-miR-124-snail网络参与调控了胃癌的EMT过程并促进胃癌的浸润和转移。结论:LncRNA GCMA在发生淋巴结转移的胃癌组织中高表达,GCMA高表达的患者预后较差。转录因子SP1可直接结合到GCMA的核心启动子区并激活GCMA的转录,从而上调GCMA在胃癌中的表达。GCMA可作为ceRNA吸附miR-124和miR-34a,上调后者的靶基因slug和snail的表达,进而抑制上皮标志物ZO-1和E-cadherin的表达,促进间质标志物β-catenin和vimentin的表达,促进EMT的发生和胃癌的浸润转移。