前言支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是采用机械通气或氧气治疗早产儿急性呼吸衰竭后并发的慢性肺疾病（chronic lung disease，CLD），是威胁早产儿健康和生命的首要疾病。随着围产医学的不断发展，极低出生体重儿的成活率明显提高，BPD的发病率也在不断上升，其病理特点由过去显著的肺间质纤维化转变为以肺泡和血管发育阻滞为突出特征。氧中毒是导致BPD的一个重要原因。将新生动物暴露于高浓度氧（高氧）环境，可以成功建立BPD的动物模型。过去人们对BPD的研究热点多集中在肺间质纤维化和肺泡发育受阻方面，对于BPD预防和治疗一直没有突破性进展。近来，血管的异常变化在肺发育阻滞中的作用日益受到人们的关注。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是调节肺血管生长的重要因子，VEGF基因疗法或重组人VEGF可促进高氧暴露大鼠肺脏毛细血管形成，改善肺泡发育。促炎因子和抗炎因子的调控失衡在BPD的发病机制中占有重要地位。单核细胞趋化蛋白—1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）和中性粒细胞趋化因子-1（cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1，CINC-1）基因的上调与BPD氧化应激导致的炎症反应有关。一定程度上抑制二者的表达可以减轻高氧肺损伤，降低BPD的发病率。近年来，促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）抗氧化、抗感染、抗凋亡及促进血管生成等作用备受关注。少数动物实验发现，EPO可能对BPD有一定防治作用，但机制尚未进一步阐明。目前对EPO和VEGF之间作用关系的研究存在分歧。EPO在炎症反应中具有类固醇激素样的抗炎作用：EPO可以减轻缺血再灌注肺损伤肺内中性粒细胞聚集、肺水肿和血清TNF-α的表达。EPO可以减轻缺氧缺血性脑损伤大鼠脑组织白细胞浸润和IL-1β的升高。本研究拟从EPO促进血管生成和抗炎作用方面，探讨EPO促进肺微血管形成的作用机制及其与VEGF之间的相互作用关系，探讨EPO在抑制高氧炎症反应中对CINC-1和MCP-1的作用，完善BPD的发病机制，为BPD的预防和治疗提供一个新思路。实验材料与方法一、动物模型新生Wistar大鼠生后12h之内随机分为4组：Ⅰ．空气对照，Ⅱ．空气+重组人促红细胞生成素（recombinant human erythropoietin，rhEPO），Ⅲ．高氧对照，Ⅳ．高氧+rhEPO。Ⅲ、Ⅳ组置于玻璃氧箱中，持续输入氧气，FiO₂=0.85±0.02（美国OM-25ME型测氧仪监测）。用钠石灰吸收CO₂，使其浓度<0.5％（Dapex气体分析仪），温度22～25℃，湿度60％～70％。每天定时开箱15min，添水、饲料及更换垫料，并与空气对照组交换母鼠以免因氧中毒而致喂养能力下降。Ⅰ、Ⅱ组吸入空气，具体方法及实验因素同Ⅲ、Ⅳ组。Ⅱ、Ⅳ组于生后0d高氧暴露前30分钟和生后2d给rhEPO 1200IU/kg背部皮下注射，Ⅰ、Ⅲ组给予等量生理盐水注射。二、标本的采集和处理于实验后3、7及14d各组随机选取8只称重，5％哥拉麻醉，取左肺1mm³置于2.5％戊二醛中固定，用于电镜观察。经气管缓慢注入10％中性甲醛至右肺，然后置于10％中性甲醛中，4℃过夜，石蜡包埋，制作5μm组织切片，用于肺形态学观察免疫组织化学检测。或于麻醉后，右心室采血，置于抗凝管中，行血红细胞、血红蛋白、红细胞压积和血小板检测；剪开左心耳，经右心室插管至肺动脉，注入10ml生理盐水洗净肺内残血，收集肺组织，置于无RNase的Eppendorf管中，液氮速冻，-80℃冰箱保存，用于Western blotting，RT-PCR和生化检测。支气管肺泡灌洗：动物麻醉后，分离气管，插入套管针，经气管缓慢注入0.5ml冷生理盐水，轻轻回抽，反复4次，汇集每次回收液，4000rpm离心10min，将上清保存在-80℃冰箱用于生化分析。三、实验方法（一）用寿命表法估计每组大鼠生存率行生存分析。（二）血液红细胞、血红蛋白、红细胞压积和血小板检测。（三）肺形态学观察：1．病理。2．辐射状肺泡计数（radical alveolar counts，RAC）。3．Masson染色。4．透射电镜观察超微结构。（四）肺组织血小板内皮细胞粘附分子-1（platelet endothelial cell adhensive-1，PECAM-1）、促红细胞生成素受体（erythropoietin receptor，EPOR）、VEGF和MCP-1免疫组化检测。（五）Western-blot法检测肺组织PECAM-1、EPOR、VEGF和MCP-1蛋白表达。（六）RT-PCR法检测肺组织EPOR、CINC-1和MCP-1表达。（七）支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）总蛋白、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）含量以及肺组织MPO含量检测。四、统计学分析应用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，数据以均值±标准差（（?）±s）表示。采用寿命表法进行生存分析，生存率比较采用Wilconxon（Gehan）检验。各组比较采用One-Way ANOVA，两两比较采用SNK（q）检验和LSD法。相关分析采用Spearman分析。结果一、一般状态和生存率Ⅲ组生后7d体重增长低于Ⅰ组，14d差异更明显（P<0.01，P<0.001），Ⅳ组体重与Ⅰ组比较无差异。Ⅳ组生存率明显高于Ⅲ组（P<0.05）二、血液红细胞、血红蛋白、红细胞压积和血小板的变化Ⅱ组红细胞、血红蛋白和红细胞压积于7d和14d均高于Ⅰ组（P<0.05，P<0.01，P<0.001），Ⅲ组红细胞、血红蛋白和红细胞压积于14d明显低于Ⅰ组（P<0.01，P<0.001），Ⅳ组红细胞、血红蛋白和红细胞压积于14d均高于Ⅲ组（P<0.05，P<0.01），与Ⅰ组无差异。各组血小板无明显改变。三、肺形态学改变（一）肺组织病理变化：Ⅰ组14d肺泡大小均匀一致，肺泡间隔较薄，肺泡毛细血管丰富，Ⅱ组14d血管增生明显。Ⅲ组3d肺毛细血管扩张、充血，间隔少量炎性细胞浸润；7d间隔有大量炎细胞浸润，肺泡腔有渗出，肺灶状出血；14d肺泡和毛细血管数量减少，形成肺大泡，间隔增厚，肺间质胶原沉积。Ⅳ组病理改变明显减轻。（二）RAC值变化：Ⅰ、Ⅱ组RAC值随日龄增加而增加。Ⅲ组RAC值7d时降低（p<0.05），14d更显著（p<0.001）。Ⅳ组RAC值在7d与Ⅰ组无差异，14d时高于Ⅲ组，但仍低于Ⅰ组（p<0.001）。（三）肺内胶原沉积的变化：Ⅲ组14d Masson染色肺间质蓝色胶原沉积增多。Ⅳ组未见间质胶原增多。（四）超微结构观察结果：Ⅰ、Ⅱ组血管丰富，血管内皮结构完整，基底膜连续，血气屏障结构清晰。Ⅲ组：3d血管基底膜有部分增厚、断裂。7d毛细血管明显减少，远离肺泡腔，血管基底膜增厚，血管腔被炎细胞堵塞，肺间质内炎细胞浸润增多，成纤维细胞增生，Ⅰ型肺泡上皮细胞固缩，Ⅱ型肺泡上皮细胞出现凋亡小体。14d毛细血管稀少，气血屏障明显增厚，间质成纤维细胞增多，弹力纤维、胶原纤维大量沉积，Ⅱ型肺泡上皮细胞可见萎缩、坏死。Ⅳ组14d血管较Ⅲ组丰富，偶见Ⅰ型肺泡上皮细胞体积增大及Ⅱ型肺泡上皮细胞萎缩，成纤维细胞增生。四、BALF总蛋白和MPO含量及肺组织MPO的变化Ⅲ组BALF总蛋白3d增加，7d最显著（P<0.001）。Ⅳ组总蛋白含量明显降低（P<0.05，P<0.001）。BALF和肺组织MPO的变化与BALF总蛋白的变化规律一致。在3d、7d和14d，各组BALF与肺组织MPO呈正相关（r=0.561，p<0.001；r=0.882，p<0.001；r=0.656，p<0.001）。五、PECAM-1、EPOR、VIEGF和MCP-1蛋白表达的变化Ⅱ组14d PECAM-1蛋白表达略高于Ⅰ组（P<0.05）。Ⅲ组7d和14d PECAM-1蛋白表达减低（P<0.001）。Ⅳ组PECAM-1表达较Ⅲ组增加，7d与Ⅰ组无差异，14d高于Ⅲ组（P<0.001），低于Ⅰ组。Ⅲ组EPOR表达减弱（P<0.05，P<0.001）；Ⅳ组表达有所增强，3d EPOR表达与Ⅰ、Ⅱ组无明显差异，7d、14d时虽高于高氧组，但仍低于正常组（P<0.001）。Ⅲ组7dVEGF表达减低，14d明显（P<0.001）；Ⅳ组VEGF表达显著增加（P<0.001）。Ⅲ组MCP-1表达增加，7天达峰值（P<0.001）。Ⅳ组MCP-1含量明显减低（P<0-001）。六、EPOR、MCP-1和CINC-1mRNA表达的变化EPOR和MCP-1mRNA的表达与其蛋白质表达的变化一致。MCP-1和CINC-1mRNA在Ⅲ组呈高表达，7d最强（P<0.001）。Ⅳ组MCP-1和CINC-1 mRNA表达较Ⅲ组减弱（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。3d、7d和14d各组肺组织MPO与MCP-1mRNA及CINC-1 mRNA表达呈正相关（r=0.628，P<0.001；r=0.841，P<0.001；r=0.72，P<0.001）（r=0.723，P<0.001；r=0.884，P<0.001；r=0.697，P<0.001）。结论1．慢性高氧（FiO₂=0.85）诱导的新生鼠BPD模型符合早产儿BPD的发生、发展特点和组织病理学改变。2．EPO能减轻高氧导致的肺部炎症反应，改善高氧导致的肺泡和微血管发育阻滞，对高氧导致BPD有一定保护作用。3．EPO可能是通过上调高氧致BPD大鼠EPOR表达，促进肺微血管的重建，从而改善肺发育。4．VEGF水平降低在BPD发生、发展中发挥重要作用，EPO通过增加高氧暴露肺组织VEGF表达，改善肺微血管的发育，对BPD有一定预防和保护作用。5．由高氧导致的早期炎症反应在BPD发生、发展中起着重要作用，BALF中MPO含量可以作为反应肺炎性损伤的程度的观测指标。EPO能明显减轻高氧致BPD早期炎性损伤。6．细胞因子CINC-1和MCP-1的表达调控着高氧致BPD早期炎细胞的趋化和聚集，EPO通过下调MCP-1和CINC-1的表达减轻肺损伤。