犬细小病毒病是由犬细小病毒（Canine parvovirus,CPV）感染引起,严重危害犬类健康的传染病,具有发病率高、传染性强、死亡率高等特点。目前犬细小病毒病没有特效药物,目前采用的单克隆抗体在CPV感染早期有良好的治疗效果,但单克隆抗体为鼠源,具有较高的免疫原性,不能连续注射。本研究通过对已有单克隆抗体进行犬源化改造,制备适合犬用的免疫原性低的抗CPV抗体药物。首先对已有抗CPV的杂交瘤细胞株4H8进行鉴定,4H8抗体亚型为IgG_2b,亲和力常数6个Ka平均值为1.02×10¹11 L/mol,只与CPV VLPs反应。经RACE-PCR提取4H8抗体可变区序列,用NCBI IgBLAST分析。将4H8抗体可变区序列与在ENA网站上查到的鼠源抗体恒定区序列组装,分别构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-L和pcDNA3.1（+）-H,共转染HEK-293、HEK-293F细胞进行表达。采用间接ELISA检测鼠源CPV基因工程抗体（CA）的表达量,CA在HEK-293F细胞中的表达量为5.97 mg/L;血凝抑制、中和试验检测其生物活性,CA在HEK-293细胞上清中的血抑和中和效价分别为1:2⁴、1:152,在HEK-293F细胞上清中的血抑和中和效价分别为1:2⁶、1:1 290。纯化CA后进行SDS-PAGE分析在55和25 Ku处出现条带;间接免疫荧光检测,CA能与CPV发生特异性结合。确定经过改造的CA依然保持活性后,进行犬源化改造。将4H8抗体可变区序列与在NCBI网站上查到的犬源抗体恒定区序列组装,分别构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-cL和pcDNA3.1（+）-cH,按照CA的方法进行表达和检测犬源CPV基因工程抗体（CCA）。CCA在HEK-293细胞上清中的血抑和中和效价分别为1:2⁵、1:203,在HEK-293F细胞上清中的血抑和中和效价分别为1:2⁹和1:2 580。CCA经Protein A亲和层析柱纯化后纯度在95%以上,血抑和中和效价分别为1:2¹²和1:32 768。经BCA法检测CCA在HEK-293F细胞中的表达量为89.65 mg/L。SDS-PAGE分析CCA在55和25 Ku处出现条带,Western-blot检测重链能与兔抗犬IgG-HRP结合,间接免疫荧光检测CCA能中和CPV。以上结果表明,本研究在HEK-293F细胞中成功表达具有中和活性、纯度高、免疫原性低的犬源化CPV基因工程抗体。