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乳蛋白的合成及调控是哺乳动物乳腺上皮细胞内非常重要的代谢过程。乳蛋白合成的机理是重要的生命科学基础问题之一,近年来的研究已有一些明显的进展。已发现催乳素通过JAK2/STAT5信号通路在转录水平控制乳蛋白生成过程,氨基酸通过m TOR/S6K1信号通路在翻译水平调控乳蛋白合成过程。但乳腺细胞内乳合成的详细生化机制尚不清楚。本实验室前期实验发现甘氨酰t RNA合成酶可以在细胞核内参与调节乳蛋白合成,然而具体调节作用方式还不知道,阐明此机制将有助于揭示乳蛋白合成的详细分子作用机制。本实验研究了蛋氨酸刺激下,甘氨酰t RNA合成酶通过ELP4对乳蛋白合成的影响,以阐明甘氨酰t RNA合成酶下游信号分子ELP4的作用机制。本研究为甘氨酰t RNA合成酶和ELP4对乳蛋白基因表达的调节及其作用机理提供基本理论依据,并为乳蛋白合成的网络信号通路提供了一个新的视野。本研究选用组织块培养法,体外培养并得到了纯化的奶牛乳腺上皮细胞,用蛋白质免疫印记(WB)和免疫荧光(IF)检测细胞中角蛋白18(CK18)和CSN2的表达以鉴定细胞的纯度和泌乳功能。实验通过在培养液中添加0.6mmol/L的蛋氨酸,建立了细胞的泌乳模型,用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和WB方法,检测添加蛋氨酸泌乳模型中,ELP4的表达情况。结果表明,在蛋氨酸促进细胞泌乳时,ELP4的表达显著上升(p<0.01)。对ELP4进行过表达并利用WB检测CSN2的表达,结果显示,ELP4过表达后CSN2表达显著上升(p<0.01)。这说明,在蛋氨酸上调CSN2表达的过程中,ELP4可能是一个重要的调节因子。本实验用免疫共沉淀(Co-IP)技术沉淀并鉴定了细胞中ELP4的相互作用蛋白Gly RS。构建真核表达载体ELP4-EGFP和Gly RS-RFP,应用激光能量共振转移(FRET)、定量免疫共沉淀和激光共聚焦共定位等技术,检测添加蛋氨酸对Gly RS与ELP4相互作用的影响。结果显示,添加蛋氨酸泌乳模型中,Gly RS与ELP4的结合显著增加(p<0.01)。对Gly RS进行过表达和干扰,WB检测ELP4和CSN2的表达的变化。结果显示,GlyRS过表达后,ELP4的表达显著增加(p<0.01),CSN2的表达显著增加(p<0.01);Gly RS干扰后,ELP4的表达显著下降(p<0.01),CSN2的表达显著下降(p<0.01)。这说明,ELP4与Gly RS结合应答蛋氨酸直接参与CSN2合成的调节。接着研究了Gly RS过表达和干扰后对p-NFκB1与ELP4的启动子序列结合情况的影响,结果表明,Gly RS过表达后,细胞中p-NFκB1与ELP4的启动子序列结合显著增加(p<0.01),Gly RS干扰达后,细胞中p-NFκB1与ELP4的启动子序列结合显著降低(p<0.01)。结果提示,在细胞中Gly RS与ELP4不仅存在相互作用,而且Gly RS还可以通过促进p-NFκB1与ELP4启动子结合,激活ELP4的转录起始,从而在转录水平调节ELP4的表达。