目的:喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一,它排在头颈部恶性肿瘤的第三位,医学界普遍认为与吸烟、饮酒、病毒感染等因素密不可分,亦可能与遗传学方面的改变以及细胞信号传导通路出现障碍有关。人类乳头状瘤病毒（HPV）对黏膜及皮肤具有很强的亲和力,尤其具备引发恶性转化潜质的高危亚型HPV对于头颈部鳞状细胞癌的致癌作用已引起学者们越来越多的关注。目前为止,越来越多的研究已经证实了高危亚型的HPV,如HPV-16和HPV-18等与喉癌的发生及预后密切相关,这些高危型病毒本身的E6/E7蛋白能够使正常细胞过度增生、分化并激活细胞内致癌相关因子,同时病毒本身DNA又能够与肿瘤细胞发生基因整合发挥致癌作用。虽然通过外科手术法、放化疗手段及靶向药物治疗能够提高对喉癌患者的治愈率,但临床上总体的治疗效果也很难令人满意,因此,提高早期HPV的诊断率并及时给予有效干预对预防和治疗喉癌至关重要。目前检测HPV的方法,如HC2法、荧光定量PCR法、免疫组化法等因对实验条件或操作技术要求较高,检测费用较昂贵或诊断周期过长,均不能够实现在基层医院普及或承担应对现场突发事件检测任务的能力,研发适用于临床上的简单、快速、高效的HPV诊断方法已迫在眉睫。此外,临床上普遍认为喉癌的不良预后通常与肿瘤晚期诊断、复发及转移密不可分,随着影像技术的不断进步及高清内窥镜的普及应用,虽然在一定程度上提升了临床医生对喉癌的诊断率,然而传统的病理诊断方式仍不能科学的反映出肿瘤病变的生物学特性,在分子水平上深入研究影响喉癌患者的分子表达差异谱对临床上寻找特异性的治疗靶点,提高喉癌患者的生存率至关重要。micro RNA（mi RNA）作为在转录后起调节作用的单链非编码调控RNA分子,行使多种生物学功能并能参与表观遗传调控过程。在一些疾病中,mi RNA的表达谱具有特征性的改变,尤其是在肿瘤的癌组织和癌旁组织中mi RNA的表达谱具有显著性差异。因此,进一步研究mi RNAs对探索喉癌的侵袭及转移机制、寻找新的诊断标记物和治疗靶点对实现喉癌的个体化治疗具有重大的理论及现实意义。本研究首先建立了一种基于颜色判定的等温核酸扩增方法——多重交联螺旋扩增法（MCLSA）,该方法可以快速、高效地从喉癌临床样本中检测出HPV-16基因。同时本研究对辽宁地区的携带有HPV感染喉癌样本的mi RNAs进行测序和筛选,为进一步研究mi RNAs与喉癌的发生及发展提供理论基础。研究方法:根据Bst聚合酶的特性和目前已经报道的等温扩增法的原理设计出一种新型的多重交联螺旋扩增法,针对HPV-16的E6/E7基因保守序列设计特异性引物并进行方法的可视化验证。建立的MCLSA法需经过特异性引物条件优化、特异性、敏感性和检测极限的测定等相关指标的评价程序,而后使用临床上收集的喉癌样本DNA进行应用效果的验证评价。随后,利用商业化纳米胶体金试剂和FITC和biotin生物素标签制备出基于MCLSA的高特异性、敏感性的新型生物传感器根据纳米胶体金法在快速检测技术中取得良好的应用效果,利用以上特点制备的生物传感器可以快速、高效地达到对喉癌样本中HPV-16 DNA检测的目的。同时,对伴随HPV感染的喉癌样本和癌旁组织中的mi RNA的基因谱测序,利用生物信息学方式对所有的mi RNA加以分析,对具有差异显著性表达的mi R-205-3p进行验证分析;利用RT-q PCR法对差异表达的mi R-205-3p进行验证分析,western-blot法验证ZEB1蛋白在转染后的TU212细胞中的表达情况,以CCK-8法、transwell小室试验等验证mi R-205-3p在喉癌TU212细胞增值、侵袭等过程中的作用。结果:采用Primer Premier 5.0软件对MCLSA法的特异性引物进行设计,其设计原理与LAMP方法相似,在MCLSA扩增过程中,扩增体系在优化条件下为62℃孵育45min是与SYBR Green I（SGI）染料混合后,阳性扩增产物呈亮绿色荧光,阴性扩增产物无明显变化。特异性试验表明,所建立的MCLSA技术具有较高的特异性,能有效地将5株HPV-16毒株与其他病原微生物区分开来,且无交叉反应出现。在敏感性分析方面,MCLSA的检测限（Lo D）约为5.4×101copes/管,比LAMP和荧光定量PCR的灵敏度高出10倍;对辽宁地区46例疑似HPV感染的喉癌样本进行检测,MCLSA和HC2试剂盒的阳性检出率为32.61%（15/46）。MCLSA法的阳性检出率高于荧光定量PCR法（100%vs 93.33%）和LAMP法（100%vs 86.67%）。因此,本研究中开发的MCLSA技术是一种潜在有用的工具可用于Po C的HR-HPV筛查。随后,本研究基于纳米颗粒的横向流动生物传感器（LFB）和建立的MCLSA法结合开发出的MCLSA-LFB方法。利用FITC标记的DNA探针与基于纳米颗粒的LFB来检测HPV-16的E6/E7基因。经过扩增条件的优化,MCLSA的扩增产物基于生物素/链霉亲和素相互作用而生成两条红色条带,阴性扩增则为一条反应条带;特异性试验表明,所建立的MCLSA-LFB检测方法对HPV-16具有良好的特异性,并能将所有的HPV-16与其它病原微生物区分开来;在灵敏度方面,MCLSA-LFB法的检出限为6 copies/管,为荧光定量PCR法和LAMP法的10倍。此外,临床样本检测数据表明,MCLSA-LFB法的检测阳性率为32.61%（15/46）高于荧光定量PCR法（93.33%）和LAMP法（86.67%）。该方法程序包括样本DNA的处理（30min）、等温反应（20 min）和结果可视化（5 min）,可在60分钟内完成。因此,建立的MCLSA-LFB法对于诊断临床样本中的HPV-16具有良好的特异性和敏感性,适合基层医疗单位对于HPVs检测的推广和应用。此外,通过mi RNA芯片筛选得到9298个差异表达的mi RNA,根据已知的和预测的mi RNA的表达水平,利用生物信息学R软件包DESeq2筛选出差异表达的mi RNA。经生物信息学比对后在喉癌组织中共有6个mi RNA表达显著上调,8个mi RNA表达显著下调。应用荧光定量PCR法对喉癌组织及癌旁组织中差异表达的14个mi RNA进行分析。通过体外培养喉癌TU212细胞并进行荧光定量PCR法和westernblot法验证,mi R-205-3p能够显著上调ZEB1基因的表达而诱导EMT过程,加快肿瘤迁移和侵袭进程,mi R-205-3p可能作为喉癌诊断和治疗的潜在生物标志物。结论:本研究建立了一种新型的等温扩增技术MCLSA法,这种基于Bst聚合酶的新型可视化等温扩增技术能够快速、有效的识别HPV-16的E6/E7基因,通过与已发表的LAMP和荧光定量PCR方法进行特异性和敏感性分析,MCLSA不仅具有高特异性和敏感性的特点,并且能够准确的鉴定出临床喉癌样本中的HPV-16基因。此外,将商业化纳米胶体金、生物素标签于MCLSA法结合制成的新型生物传感器,同样具有高敏感性和特异性的优势,不仅能够缩短检测时间、提高检测极限,同时便于储存的优点更加使MCLSA-LFB法具备了临床上筛查HPV提供新的检测试剂盒的可能。对伴随HPV感染的喉癌样本和癌旁组织进mi RNA表达谱的测序并通过生物信息学手段分析显著性差异表达的mi RNA,提示可在喉癌的发展过程中mi R-205-3p表达上调可能发挥促癌基因的作用,通过影响EMT而促使喉癌的发展,但其具体的机制仍有待进一步研究。