论文部分内容阅读
硝基酚类物质是一类重要且常用的化工原料,作为原材料或中间体被广泛应用于炸药、医药、杀虫剂、染料、木材防腐剂和橡胶等生产中;硝基酚在生产和使用过程中,会随着工业废水的排放对环境造成污染,对硝基苯酚(p-Nitrophenol,PNP)是化工、印染、医药和炸药等行业的重要原料之一,而且也是有机磷农药,如甲基对硫磷(Methyl Parathion,MP)的中间代谢产物,是一类较为普遍的环境污染物质。进入环境的PNP会长期残留在土壤和水中,对动植物和人类健康产生威胁。许多学者都致力于研究对硝基苯酚的生物降解,但研究只是处于筛选到的微生物只能够降解低浓度的对硝基苯酚,降解过程中产生的亚硝酸盐很难除去,也有学者利用构建基因组文库的方法克隆到了能够降解对硝基苯酚的基因簇。本研究利用富集培养法,从华阳农药厂污水处理池的活性污泥中筛选并获得多株能够高效降解PNP的细菌菌株,其中菌株Y1具有较好的降解性能;并对Y1的降解特性、降解机理及降解酶基因进行了研究,研究内容如下:1.从华阳农药厂污水处理池的活性污泥中筛选了多株能够高效降解PNP的细菌菌株,从中筛选到一株降解性能较好的菌株,将其命名为Y1,通过形态学、生理生化和16S rDNA序列同源性分析,将其鉴定为节杆菌属(Arthrobacter sp. Y1);其16S rDNA基因序列在GenBank中的注册号是EU282772。2.纯培养的条件下,运用紫外分光光度计法(UV-Vis)和高效液相色谱(HPLC)法,测定了菌株Y1对PNP的降解性能。在pH 7和30℃条件下,Y1能够将50 mg/L的PNP在6 h内完全降解,同时测定了不同接种量、外加碳源、温度、pH及PNP浓度对菌株降解能力和菌体生长的影响,结果表明:在以PNP为唯一碳源存在的条件下,接种量0.10～0.3 g/L、温度15～40℃、pH 6～11、PNP浓度在100~400 mg/L的条件下,菌株的降解效果较好;菌株能够耐受PNP的浓度为600 mg/L,在外加碳源(0～30 g/L)存在的条件下,能够促进菌株对PNP的降解,如果外加碳源浓度过高(30～50 g/L),菌体对PNP的降解会受到抑制。3.通过HPLC和UV-Vis测定表明,4-硝基儿茶酚(4-NC)是主要的代谢产物,随着降解的进行,4-NC逐渐被降解,最终转化为二氧化碳和水;Y1能够在以4-NC为唯一碳源和氮源的培养基中生长,表明菌株对PNP的降解主要是以4-NC途径进行,4-NC途径也是革兰氏阳性菌降解PNP的典型途径。4.研究了经PNP诱导的培养物的上清液对PNP的降解,结果发现:在不接菌的条件下,上清液能够降解PNP为二氧化碳和水,结果表明降解酶是一种胞外酶。5.由于菌体是通过4-NC途径对PNP进行降解,根据已注册的能够通过4-NC途径降解PNP的基因簇设计两组特异性引物,分别进行PCR扩增,其中一组引物经PCR扩增后得到一条大约1.5 kb的条带,对这个条带进行测序分析,发现它与已知编码双加氧酶的氧化酶组分同源,而且经过功能分析表明,它能够将PNP转化为4-NC,该基因的注册号为EU282773。6.运用SDS-PAGE对诱导和非诱导条件下菌体的全细胞蛋白质电泳分析表明,诱导条件下菌体的全细胞蛋白质电泳出现了多条差异条带,推测降解酶是诱导型表达的;菌体粗酶液活性分析表明,诱导条件下和非诱导条件下菌体的粗酶液都能够快速将对硝基苯酚降解为无毒物质;诱导条件下粗酶液降解对硝基苯酚的速率是非诱导条件下的7.2倍,说明降解酶在诱导条件下可以迅速降解对硝基苯酚,但是在非诱导条件下,降解酶可以组成型表达。