内蒙古绒山羊（阿尔巴斯型）是内蒙古自治区的特有品种,具有长毛型和短毛型两种不同的毛被类型。课题组在前期研究发现LOC108637647基因在绒山羊不同毛被类型中显著差异表达,为了深入研究该基因的功能,本实验通过CRISPR（Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats）/Cas9（CRISPR-Associated proteins）技术建立LOC108637647敲入（KI）小鼠模型,并对该模型小鼠的毛被变化进行了相应研究。研究结果如下:1 CRISPR/Cas表达载体的设计与构建。通过CRISPR/Cas技术在C57BL/6N小鼠ROSA26位点特异性敲入LOC108637647基因。设置g RNA长度为20nt,g RNA的GC含量百分数为40%至60%之间,利用g RNAcas9软件对靶序列进行分析运算,从而筛选出符合条件的g RNA靶位点。“CAG promoter-lox P-3*polyA-lox PKozak-goat LOC108637647 CDs-polyA”元件插入ROSA26基因的内含子,内蒙古绒山羊LOC108637647 CDs的表达量受到Cre重组效率的影响。2 LOC108637647基因敲入小鼠繁殖与鉴定。使用g RNA将含有CAG promoter-lox P-3*polyA-lox P-Kozak-goat LOC108637647 CDs-polyA载体引导至小鼠ROSA26基因,与Cas9 m RNA共注射到小鼠受精卵中,以产生靶向的条件敲入子代。通过PCR进行序列分析鉴定F0代动物,将其培育成野生型小鼠以测试种系传递和F1动物世代。用组织特异性Fabp4-cre小鼠培育F1代小鼠以产生F2。用Cre+小鼠繁殖纯合小鼠。通过PCR对幼鼠进行基因分型,然后进行测序分析。3 LOC108637647基因敲入小鼠表型检测。制作基因编辑小鼠皮肤组织石蜡切片,显微镜下观察。结果表明,相较于野生型小鼠,在阳性鼠体表左右体侧及腹部,尤其是左侧部,前肢下部1.0-1.5cm处表型变化明显,出现斑秃、脱毛及全身毛发稀疏等现象,阳性鼠在毛囊数量和毛囊形态均出现较大差异。LOC108637647羊源基因在敲入小鼠皮肤后对小鼠毛囊的生长发育,特别是皮肤毛囊数量,毛囊形态有较大的影响。这显示LOC108637647可能直接或间接参与了皮肤毛囊的分化过程。其具体的作用机制,仍需进一步研究。