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研究背景骨肉瘤（OS）是最常见的原发性恶性骨肿瘤,尽管每年的发病率仅为每百万人三例,但死亡率却极高。MicroRNA（简称miRNA）是一类长约22nt的非编码小RNA分子,在RNA沉默和基因转录后调控中发挥着重要的作用。在人类肿瘤中,miRNA的表达谱已经确定与诊断、分期、进展、预后和治疗反应有关。在骨肉瘤中,miRNA可以作为疾病发病与进程中的标志之一。MiR-708-5p近年来被证实在促进或抑制实体肿瘤与血液系统肿瘤中具有重要作用。本研究拟探究miR-708-5p对人骨肉瘤细胞株迁移、侵袭的作用及其机制。目的检测miR-708-5p在人骨肉瘤细胞株MG63和SaOS-2中的表达水平;以骨髓基质细胞HS-5和人骨髓来源的间充质干细胞（hMSC）作为正常对照细胞,通过阳离子脂质体介导法过表达miR-708-5p并检测miR-708-5p对骨肉瘤细胞迁移、侵袭的影响并探讨其作用机制。方法1.人骨肉瘤细胞株MG63和SaOS-2中miR-708-5p的表达水平:对GEO数据库中数据集GSE70367中的miRNA进行GEO2R分析,以hMSC细胞作为正常对照组,选取TOP250分析中的TOP50（log|FC|>1,P<0.05）,利用HemI软件制作热图。采用RT-qPCR检测miR-708-5p在骨肉瘤细胞株MG63、SaOS-2和正常细胞hMSC、HS-5中的表达水平。2.人骨肉瘤细胞株中miR-708-5p的过表达对骨肉瘤细胞迁移和侵袭的作用:通过阳离子脂质体介导法过表达miR-708-5p,RT-qPCR法检测骨肉瘤细胞株MG63和SaOS-2中miR-708-5p过表达情况。应用划痕愈合实验、Transwell小室法检测过表达miR-708-5p的骨肉瘤细胞株MG63和SaOS-2的迁移与侵袭。3.过表达miR-708-5p对骨肉瘤细胞株MG63、SaOS-2上皮-间质转化（EMT）相关分子以及基质金属蛋白酶（MMP）表达的影响:采用RT-qPCR、Western blot法检测过表达miR-708-5p后骨肉瘤细胞MG63中MMP2、7和9的mRNA以及蛋白质表达水平;采用RT-qPCR、Western blot法检测过表达miR-708-5p后骨肉瘤细胞SaOS-2中MMP2、9的mRNA以及蛋白质表达水平。采用Western blot检测过表达miR-708-5p后骨肉瘤细胞MG63、SaOS-2中上皮标志物E-cadherin和间质标志物N-cadherin、Vimentin的蛋白质表达水平的变化。4.miR-708-5p靶基因的预测及验证:利用Targetscan7.2（http://www.targetscan.org/vert72/）预测miR-708-5p的靶基因,应用双荧光素酶报告基因实验验证miR-708-5p与预测靶基因的结合关系。结果1.对数据集GSE70367中的miRNA进行基因富集分析发现,与正常细胞hMSC相比,miR-708-5p在骨肉瘤细胞株MG63、SaOS-2、Hu09、NY、HOS中表达水平降低（P<0.05）。选取MG63与SaOS-2细胞作为研究对象,RT-q PCR结果显示,与正常细胞HS-5和hMSC相比,miR-708-5p在骨肉瘤细胞MG63和SaOS-2中表达水平降低（P<0.05）。2.RT-q PCR结果显示,20n M的miR-708-5p mimics分别转染MG63与SaOS-2细胞24h后,miR-708-5p表达水平显著升高（P<0.05）。成功过表达miR-708-5p后,划痕愈合与Transwell实验结果显示,相较于阴性对照组,MG63与SaOS-2细胞的迁移与侵袭率均受到显著抑制（P<0.05）。3.RT-q PCR和Western blot结果显示,相较于阴性对照组,在MG63中过表达miR-708-5p后,MMP2、7、9的m RNA和蛋白质表达水平均显著下降（P<0.05）。在SaOS-2中过表达miR-708-5p后MMP2、9的m RNA和蛋白质表达水平均显著下降（P<0.05）。Western blot结果显示,在MG63和SaOS-2细胞中过表达miR-708-5p后上皮标志物E-cadherin蛋白质表达水平上调（P<0.05）,间质标志物N-cadherin、Vimentin蛋白质表达水平下调（P<0.05）。4.Targetscan7.2预测出miR-708-5p与SEMA4C（Semaphorin 4C）、MAP3K3（mitogen-activated protein kinase kinase kinase 3）和ZEB1（zinc finger E-box-binding homeobox 1）的3’UTR区均有结合位点,双荧光素酶报告基因实验结果显示miR-708-5p与SEMA4C、MAP3K3和ZEB1的3’UTR区有直接结合。Western blot结果显示,miR-708-5p在MG63和SaOS-2细胞中过表达后SEMA4C和MAP3K3的蛋白水平并无显著改变,而ZEB1的蛋白质表达水平显著下调（P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验与Western blot实验结果表明miR-708-5p在骨肉瘤细胞中直接靶向ZEB1。5.在骨肉瘤细胞MG63和SaOS-2中过表达miR-708-5p后恢复ZEB1的表达可以部分解除miR-708-5p对MG63和SaOS-2细胞迁移、侵袭的抑制作用。6.在骨肉瘤细胞MG63和SaOS-2中干扰ZEB1的表达后能显著抑制细胞的迁移与侵袭能力。结论1.相较于正常细胞HS-5与hMSC,miR-708-5p在骨肉瘤细胞MG63和SaOS-2中低表达。2.miR-708-5p通过抑制EMT进而抑制骨肉瘤细胞MG63和SaOS-2的迁移与侵袭能力。3.在骨肉瘤细胞MG63与SaOS-2中ZEB1是miR-708-5p的下游靶基因之一。4.miR-708-5p通过下调ZEB1的表达来抑制骨肉瘤细胞MG63和SaOS-2的迁移与侵袭能力。