研究背景:亚临床甲状腺机能减退症（Subclinical hypothyroidism,亚甲减,SCH）是指临床上无明显症状或仅有轻微甲减症状,只有血清促甲状腺激素（Thyroid stimulating hormone,TSH）升高,而血清中游离三碘甲状腺原氨酸（Free tri-iodothyronine,FT3）、以及游离四碘甲状腺原氨酸（Free thyroxine,FT4）在正常范围的一种内分泌疾病。亚甲减是一种常见的甲状腺疾病,在全球的患病率越来越高,并且随着年龄的增长亚甲减的患病率逐渐增高。美国第三次国家健康数据研究指出,相比于年轻（20-29岁）人群,年龄增加（60-69岁）的人群中,血清TSH水平大大升高,较年轻人群升高约40%。亚甲减常伴有动脉粥样硬化（Atherosclerosis,动粥,AS）的现象近年来成为一个热点话题。亚甲减与高血压、高血脂、高血糖、和吸烟一样,也是心血管事件,如AS和心肌梗死的独立危险因素。数项来自不同地区对亚甲减人群的研究都证实了亚甲减与心血管事件紧密相关,比如荷兰的鹿特丹研究,以及英国的Whickham队列研究。越来越多的荟萃分析从循证医学角度支持该论断,比如最近来自台湾的一项荟萃分析,以及另一项基于美洲、欧洲、、亚洲等11个国家以往研究数据的荟萃分析均表明,亚甲减程度加重与冠心病的发生率和死亡率的升高具有相关性,且在TSH在高于10 mIU/L的重度亚甲减组中更明显。这些临床研究在循证医学角度提示了亚甲减和心血管事件的相关性。AS是心血管疾病的起始病因,是以动脉血管壁的斑块形成为特征的慢性疾病。AS的发生病变主要有以下三个过程,首先,内皮细胞受到各种刺激出现内皮功能损伤,平滑肌细胞增生,巨噬细胞迁移及浸润,淋巴细胞浸润,进而释放炎症和趋化因子。其次,平滑肌细胞在各种刺激下分泌胶原纤维,弹性蛋白等形成结缔组织。再次,脂质（包括被修饰的以及游离的脂蛋白）在基质和泡沫细胞中聚集。AS的形成机制目前多种学说,如炎症学说、脂质氧化应激学说、免疫应答学说,但至今仍缺少确切的证据能证明任一学说在AS形成中有决定性作用。慢性炎症学说是目前比较公认的AS的发生假说之一。AS的发生发展伴随着慢性炎症为特征的病理过程。传统观点认为,甲减及亚甲减伴随的AS是由于甲状腺激素的作用。而我们课题组近年来发现TSH独立于甲状腺激素的一些在非甲状腺靶器官的重要作用。TSH作为一种垂体分泌的促激素,作用于人体的TSH受体（TSHR）而发挥作用。传统意义上,TSH作用于甲状腺上的TSHR,发挥促进甲状腺激素合成和分泌的作用。除了该传统意义的作用,近年来,TSHR被发现分布于体内的很多其他的细胞及组织,即TSH可能通过结合这些TSHR,发挥除了甲状腺以外的其他重要作用。我们课题组前期也证实了 TSH通过TSHR介导,在肝脏细胞,脂肪细胞等多个甲状腺外细胞中发挥了重要作用。基于以上理论,我们提出假说,TSH可能是AS的独立危险因素。TSH通过作用于AS发生和发展过程中相关的细胞或组织中的TSHR,发挥直接的作用,从而影响AS的形成。本研究拟从临床研究发现问题,并行动物实验探究机制,探究TSH对AS影响可能的机制。从临床数据和基础实验两方面来阐述TSH对动脉粥样硬化的影响。研究目的:1.观察人群中血清TSH水平与动脉粥样硬化指标的相关性。2.研究人群中与动脉粥样硬化相关的炎症因子谱与TSH的相关性。3.观察TSH对动脉粥样硬化发生发展的作用。4.初步探讨TSH对动脉粥样硬化影响的可能的作用机制。研究方法:一、人群队列研究1.人群选择及资料获取:人群来自2011-2012全国代谢性疾病流行病学调查项目中的人群,即2011年于山东省宁阳县收集的人群,共2480人。经过严格的排除和纳入标准筛选后,共有1103人进入我们的研究,进行横断面回顾性分析。通过调查问卷记录人群的一般资料,包括性别、年龄、既往疾病史、用药史、吸烟饮酒史等。通过查体,获得血压、体重、身高、腰围、臀围等信息。2.血清甲状腺功能及各项生化指标测定:收集空腹血,离心获得血清。用生化方法测定血脂、血糖等指标。用化学发光法测定甲状腺激素水平（FT3,FT4,TSH）。以上检测都在山东省立医院检验科由检验科专业人员完成。3.颈动脉超声测量颈动脉内中膜厚度:所有患者行颈动脉内中膜厚度（CIMT）测量。颈动脉内中膜增厚诊断参照中国高血压防治指南中的定义（2010）。颈动脉超声检测由山东省立医院专业超声科医师完成。4.Elisa及Luminex多因子试剂盒检测血清炎症因子:Elisa方法测定TNF-α水平。用RD公司的Luminex多因子的试剂盒测定人血清中的炎症因子,包括（IL-6,IL-1,IL-10,IL-12,CD40L,CX3CL1,CCL2,GM-CSF）。5.统计分析;连续变量以均数±标准差表示。多组间比较均采用one-way ANOVA分析。采用多元线性回归检测各因素对CIMT的作用。所有数据均用SPSS18.0软件进行分析,定义P<0.05为具有显著性差异。二、机制研究1.基因敲除小鼠的构建:8周龄的雄性ApoE/-小鼠购自于北京维通利华公司,Tshr-小鼠购自于美国Jackson Lab。ApoE-/-与Tsh+/-小鼠杂交,进一步筛选Tshr-ApoE双敲小鼠,同窝Tshr+/+ ApoE-/-作为对照组。即ApoE-/-敲除背景下的Tshr-/-和Tshr+/+小鼠。2.动脉粥样硬化模型构建:上述双敲及对照组小鼠,于6周龄时给与西方高脂饮食喂养。高脂饮食喂养12周,16周。高脂喂养之后处死小鼠,留取标本。3.组织样本采集:高脂喂养12周,16周处死小鼠,取小鼠全血,静置离心后取得血清。留取主动脉全长。主动脉根部直接固定于OCT中,或固定于福尔马林中。进行冰冻切片或石蜡切片的准备。4.组织学染色以及免疫组织化学染色:主动脉根部组织包埋,分别准备冰冻切片以及石蜡切片。主动脉根部连续切片,进行各种染色,如HE染色,油红O染色。免疫组织化学染色:平滑肌指标α-SMA,巨噬细胞指标F4/80,天狼猩红染色评估胶原,分析斑块的各种成分。免疫组化染色评估斑块内炎症因子（IL-6,TNF-α）表达水平。5.血脂及甲状腺功能水平测定:血清用化学发光法进行血脂测定（TC,TG,LDL-c,HDL-c）,用Elisa方法测定小鼠血清促甲状腺激素（TSH）,用放射免疫法测定甲状腺激素（T3,T4）。6.小鼠血清炎症因子的测定:用Elisa方法测定小鼠血清的炎症因子IL-6,TNF-α的水平。7.小鼠血管炎症因子基因水平检测:小鼠主动脉血管组织提取mRNA,反转录cDNA,进行PCR实验,检测血管中一系列炎症因子RNA水平的变化。8.小鼠巨噬细胞原代获取:从小鼠腹腔获取巨噬细胞原代细胞,经过观察和鉴定,进行体外培养。9.体外巨噬细胞实验:体外培养巨噬细胞,加TSH处理,用Elisa测定培养基中分泌的炎症因子。10.统计学分析:定量数据用均数±标准差的形式表示。用SPSS进行数据分析,两组之间比较采用独立样本t检验,多组采用one-way ANOVA检验,定义P<0.05为有统计学差异。结果:1.TSH是动脉粥样硬化的独立危险因素共有1103人纳入最后的分析,其中甲功正常组787人,轻度亚甲减组279人,重度亚甲减组37人。按TSH水平分为以上三组,颈动脉内中膜厚度（CIMT）随TSH的升高而升高。与对照组相比,轻度亚甲减与重度亚甲减组均有统计学差异（P<0.001）。斑块的发生率和组内人均的斑块数目都随TSH的升高而升高。与对照组相比,轻度亚甲减与重度亚甲减组均有显著性差异（P<0.01）。多元线性回归模型显示,TSH与其他公认的动脉粥样硬化的危险因素,如血脂、血压、血糖等,同时都可以进入多元线性回归的方程,是CIMT的独立的影响因素。2.血清中与AS相关的炎症因子谱随TSH增加而逐渐升高测定了部分人群中与动脉粥样硬化相关的一系列炎症因子,发现TNF-α随TSH升高而升高,轻度亚甲减及重度亚甲减较对照组相比,均有显著升高（P<0.001）。另外,血清中趋化因子CCL2,轻度亚甲减组较对照组相比,明显升高（P<0.01）,重度亚甲减较对照组相比,也有显著性升高（P<0.05）。血清中集落刺激因子GM-CSF,轻度亚甲减较对照组相比,有明显升高（P<0.01）。3.Tshr敲除减轻ApoE-/-小鼠的AS的发生与对照组（Tshr+/+ApoE-/-）相比,双敲组（Tshr-/-ApoE/-）小鼠的血脂（TC,TG,LDL-c,HDL-c）并无明显变化。两组小鼠的甲功（T3,T4,TSH）也无明显差别。大体油红染色显示,与对照组（Tshr+/+,ApoE-/-）相比,双敲组（Tshr-/-ApoE-/-）小鼠整个主动脉中动脉粥样硬化斑块形成减少。在高脂喂养12w和16w均有显著性差异。主动脉根部油红O染色显示:与对照组（Tshr+/-ApoE-/-）相比,双敲组（Tshr-/-ApoE-/-）小鼠主动脉根部斑块减少,高脂喂养12w和16w均有显著性差异（12w,P<0.01;16w,P<0.001）。斑块中的巨噬细胞F4/80染色显示:与对照组（Tshr+/+ApoE-/-）相比,双敲组（Tshr-/-ApoE-/-）斑块中的巨噬细胞减少（12w,P<0.001;16w,P<0.01）。4.Tshr敲除减轻ApoE-/-小鼠的炎症反应小鼠血清中炎症因子测定:发现与对照组（Tshr-/-ApoE-/-）相比,双敲组（Tshr-/-ApoE-/-）小鼠血清的炎症因子IL-6,TNF-α明显降低,且有统计学差异（IL-6,P<0.01;TNF-α,P<0.05）。小鼠血管组织RNA水平表达:与对照组（Tshr+/+ Apo-/-）相比,双敲组（Tshr-/-ApoE-/-）小鼠血管的一系列炎症因子表达下降。与对照相比,多项因子（F4/80,P<0.05;IL-1β,P<0.05;IL-6,P<0.05;TNF-α,P<0.05;Ccl2,P<0.01）均有显著性降低。血管斑块中的炎症因子表达:免疫组化显示,与对照组（Tshr+/+Apo-/-）相比,双敲组（Tshr-/-ApoE-/-）小鼠斑块组织中IL-6和TNF-α的表达均降低（IL-6,P<0.05;TNF-a,P<0.01）。以上可说明,双敲组（Tshr-/-ApoE-/-）小鼠整体血清、血管组织、斑块中的炎症反应均有所减轻,可能是双敲敲除小鼠AS减轻的原因。5.TSH可促进原代巨噬细胞的炎症因子分泌。获取野生型小鼠腹腔原代巨噬细胞,加入TSH处理,发现TSH可以促进原代巨噬细胞重要的炎症因子IL-6,TNF-α的分泌。且呈剂量依赖性,即0.1μmol,0.4μmol,1μmol的TSH处理,炎症因子IL-6,TNF-α的分泌逐渐升高。提示TSH可以直接促进细胞的炎症反应。结论:1.TSH是动脉粥样硬化的独立危险因素。2.血清中与动脉粥样硬化相关的炎症因子谱随TSH的增加而升高。3.TSH可以直接促进动脉粥样硬化的发生。4.TSH促动脉粥样硬化的发生可能与其促进炎症反应有关。