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第一部分瘦素在肝纤维化组织中的表达研究目的:探讨瘦素在肝纤维化发生、发展中的表达及临床意义。方法:应用免疫组织化学方法检测了30例肝组织,其中10例正常肝组织和20例肝纤维花组织,了解肝组织中瘦素的表达情况。结果:与正常肝组织相比,瘦素在肝纤维化组织中的表达显著增加(P<0.01)。肝纤维化组织中胆小管上皮细胞和肝细胞呈瘦素免疫反应阳性。结论:瘦素的异常表达与肝纤维化的发生、发展有关,提示瘦素参与了肝纤维化的病理过程。第二部分靶向瘦素基因的siRNAs真核表达质粒筛选平台的建立目的:构建具有特异性瘦素(leptin)基因siRNA功能的表达载体,筛选有效的靶向瘦素基因的siRNA真核表达质粒。方法:以leptin为目的基因,以产生siRNA质粒载体psiRNA-hH1neo为表达模板,细胞内转录合成7对特异的siRNAs,即siRNA278、siRNA108、siRNA97、siRNA454、siRNA146、siRNA237、ssiRNA108,其中ssiRNA108为对照siRNA。构建能在真核细胞中表达的靶向瘦素基因的siRNAs重组质粒,用酶切方法和测序法对重组体进行鉴定。应用脂质体介导重组质粒转染HSC,用MTT检测细胞体外黏附能力。结果:①酶切和序列测定表明,成功构建了靶向leptin的siRNAs表达载体;②与未转染组相比,转染外源重组质粒的细胞,体外黏附能力受到显著抑制,黏附抑制率在32.52%～87.82%间,在转染psiRNA97、psiRNA108、psiRNAl46、psiRNA237、psiRNA278、psiRNA454、pssiRNA108后,细胞黏附率分别是32.52%、35.07%、69.80%、66.45%、55.45%、49.76%、87.82%。其中siRNA278、siRNA108、siRNA97、siRNA454的抑制效果较强。结论:本研究构建的leptin siRNAs表达载体中siRNA278、siRNA108、siRNA97和siRNA454有较强的抑制HSC的黏附力。第三部分靶向瘦素基因的siRNAs对肝星状细胞生物学活性的影响目的:研究靶向leptin基因的siRNAs在大鼠肝星状细胞中leptin表达情况及对HSC生物学特性的影响。方法:把siRNAs真核表达载体转入HSC细胞内,筛选稳定细胞克隆,应用RT-PCR、Western blot、免疫细胞化学和流式细胞仪等方法,分析靶向leptin基因的siRNAs在HSC的表达及HSC细胞的增殖和、活化和胶原的沉积来评价siRNAs对活化型肝星状细胞生物学活性的影响。结果:靶向leptin基因的siRNAs在转染的细胞内可以下调基因的表达,抑制HSC的增殖、细胞的活化和胶原的沉积。结论:靶向leptin基因的siRNAs通过抑制靶基因及下游基因的表达逆转活化型HSC的生物学特征,因此为肝纤维化的基因治疗提供一种新的方法。第四部分靶向leptin的siRNAs对瘦素信号转导机制等的影响目的:检测靶向leptin的siRNAs对信号转导蛋白p-STAT3和细胞因子TGFβ1的影响,初步探讨siRNAs对leptin的信号传导机制等的影响。方法:采用脂质体2000转染siRNAs重组质粒,HSC细胞经过300μg/ml G418筛选4周后收集细胞,采用RT-PCR和Western Blot和免疫组化方法检测转染细胞的TGFβ1和信号转导相关蛋白p-STAT3的表达。结果:与未转染组相比,转染siRNAs后,HSC中p-STAT3、TGFβ1表达下降。结论:p-STAT3、TGFβ1参与了leptin在肝纤维化中的信号转导;siRNAs抑制信号转导对于肝纤维化的治疗有一定的前景。第五部分siRNA联合α-干扰素抗肝纤维化的实验研究目的:实验研究表明siRNA对肝星状细胞有抑制作用。本实验拟进一步研究α-干扰素(alpha-interferon,α-IFN)与靶向leptin的siRNA97单独及联合作用对肝星状细胞体外活性的影响。方法:构建靶向leptin的siRNA97,用α-IFN和siRNA97处理HSC,通过绘制细胞生长曲线、软琼脂集落形成实验、流式细胞术(FCM)来研究其对细胞的增殖抑制作用,ELISA法测定细胞上清液中Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量,PCR-ELISA试剂盒测定细胞的端粒酶活性。结果:与对照组相比,α-IFN和siRNA97均能明显抑制HSC增殖(P<0.05),α-IFN和siRNA97联合应用时抑制作用较二者单独作用时强(P<0.01);细胞在软琼脂中集落形成率明显下降(P<0.01);可降低端粒酶活性的表达(P<0.05);FCM显示细胞周期移行被阻滞于G0/G1期;细胞上清液中Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量明显降低(P<0.01)。结论:siRNA97联合α-IFN的体外抗纤维化作用比单独应用α-IFN和siRNA97效果好。第六部分奥曲肽对大鼠肝星状细胞胞质内游离钙及细胞增殖的影响目的:探讨在常氧和低氧条件下奥曲肽(octreotide)对大鼠肝星状细胞(HepaticStellate Cell)胞内游离钙([Ca2+]i)及增殖的调节。方法:采用钙荧光探针(Fura-2/AM)负载培养的大鼠HSC,观察常氧和低氧条件下培养48h后octreotide对HSC的[Ca2+]i的调节,同时用四唑盐(MTT)比色法比较不同浓度的octreotide对大鼠HSC增殖的影响。环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)放免分析药盒测cAMP、cGMP浓度。结果:与常氧条件相比,低氧条件下HSC[Ca2+]i显著升高(P<0.01),其值分别为(137.7±7.8)和(293.2±12.4)nmol/L。500、800和1000μg/L octreotide在常氧状态下可引起HSCs的[Ca2+]i降低(P<0.05),其值分别为(92.5±2.5)、(83.8±2.3)和(76.6±2.2)nmol/L。低氧时500、800和1000μg/L octreotide可引起HSCs的[Ca2+]i降低(P<0.01),其值分别为(204.3μ7.4)、(174.1±4.8)和(156.6±6.6)nmol/L。常氧对照组A值(0.232±0.016)明显低于低氧对照组(0.533±0.036),(P<0.01); 经500、800和1000μg/L octreotide处理后,无论是常氧还是低氧状态下A值均明显降低(P<0.01)。低氧条件下cAMP和cGMP含量不发生改变(P>0.05);无论是常氧还是低氧状态,经过octreotide 500μg/L处理后,cAMP和cGMP含量增高(P<0.05),而octreotide 800、1000μg/L组更高(P<0.01)。结论:缺氧可通过第二信使系统促进HSC的增生,而octreotide无论常氧还是低氧条件下剂量依赖性抑制HSCs增殖;cAMP、cGMP参与了对HSC的调节。