研究背景和目的临床上的普通而又多见的腹股沟斜疝手术的切口牵拉疼模型(SMIR)成功模拟了临床日常手术的术后持续性疼痛。持续性术后疼痛的关键机制的阐释目前存在争议；是否这些疼痛的综合征来源于皮肤切割,炎症(例如肌肉的创伤)或者外科导致的外周神经损伤所诱发的神经病理性疼痛,目前哪种因素导致持续性术后疼痛仍然未明,也许以上3种的因素共同作用所致目前临床中对于此类手术的术后疼痛机制未明。在此模型提出之前的两个切口痛模型均诱发了3-5天的术后机械痛。但是,这些模型并不能准确的反映临床术后疼痛的产生,例如手术中的组织牵拉的操作被忽略。此模型中1h的肋骨牵拉使50%大鼠产生了持续性的机械性疼痛。2008年,Flatters建立了模拟腹股沟斜疝手术的切口牵拉疼痛模型,成功的诱发了术后的持续性疼痛,目前在模拟临床皮肤肌肉牵拉后持续性疼痛研究领域作出了很大的贡献。右美托咪定(DEX, Dexmedetomidine)是一个新型的α2肾上腺素受体激动剂,在不同的临床研究中均被证明能够增强局麻药的效应并延长局麻药的作用时间。但是,目前尚无研究证明外周神经周围预防性给予强化的局麻药能有效地减轻术后的急性疼痛和慢性疼痛。特别是给药后神经系统的超微病理改变仍然未阐明。因此,很多临床医生忽略了预防性镇痛的重要性。日益增多的证据证明单侧神经的损伤能导致的同侧和对侧疼痛的痛觉敏感。此现象被称为镜像痛(MIP, mirror image pain)。本研究的前期研究(第一、第二部分)发现镜像痛在神经牵拉的模型中存在。但是模型的创始人Flatters和Sarah在其研究报告中提及对侧的行为学改变并不受牵拉侧的操作影响。在前期研究中,我们不仅发现行为学出现了镜像改变而且胶质细胞也在对侧活化。胶质细胞目前被认为参与了MIP的机制；但是究竟胶质细胞是如何参与MIP暂时未能被阐明,且无文献报道超前应用罗哌卡因复合右美托咪定后在神经牵拉的镜像疼痛的减轻中是否起作用。目的和意义本研究将会围绕此成功建立的术后持续性疼痛模型,展开一系列的研究并与临床常用麻醉与镇痛方法紧密结合,探讨不同的用药配伍方案与术后持续性疼痛的程度的相关性和安全性,为临床的麻醉与镇痛方案制定提供基础理论依据。材料与方法第一部分研究方法实验选用雄性SD大鼠32只,随机分成2组(n=16),S组(SMIR组)和C组(对照组/单纯切皮并牵拉组),2组分别进行SMIR切口牵拉手术和单纯切皮并牵拉术。成功建立模型后,所有大鼠分别进行行为学测试(Von Frey机械痛测试,热痛测试),分别在第3天和第28天对2组大鼠进行取材,取隐神经、L3-4背根神经节,分别进行尼氏染色光镜下观察、电镜观察和免疫荧光观察(OX-42和GFAP阳性)细胞的活性。第二部分研究方法 SD大鼠(n=64)(180-220g)在腹腔注射10%的水合氯醛(100mg/ml)400 mg/kg,随机分为4组,S组(SMIRsurgery group),R组(Ropivocaine group),RD1组(Ropivocaine复合1微克DEX)和RD5组(Ropivocaine复合1微克DEX)。SMIR模型被选择为第二部分的研究模型,行为学测试进行至建立模型后第14天,在术后第3天每组的8只大鼠用于取材,隐神经和背根神经节在光镜和电子显微镜下进行分析。第三部分研究方法48只SD大鼠(180-220g)被随机纳入本研究的3组中。S组(n=16)：在SMIR手术操作前,隐神经周围注射0.9%生理盐水,8只大鼠被应用于行为学测试,余下8只大鼠分别在术后第3天和术后第28天取材并进一步分析；R组(n=16)：在SMIR手术操作前,隐神经周围注射单纯0.5%罗哌卡因,8只大鼠被应用于行为学测试,余下8只大鼠分别在术后第3天和术后第28天取材并进一步分析；RD,组(n=16)：在SMIR手术操作前,隐神经周围注射单纯0.5%罗哌卡因复合DEX微克,8只大鼠被应用于行为学测试,余下8只大鼠分别在术后第3天和术后第28天取材并进一步分析。取材后的大鼠DRG应用于免疫荧光和高倍电镜的观察。统计学处理定量资料以均数加减标准误/差的方式表达,定量资料组间选择单因素方差分析进行统计学分,组内(不同测量天数)的定量资料选择重复测量方差分析,两组数据的比较选择独立样本的t检验；定性资料以卡方检验进行统计学分析。P<0.05有统计学差异。结果第一部分术后第1至5天,S组机械痛程度达到峰值,C组机械痛达峰时点仅在第3天;C组在第5天基本恢复至正常值,S组在第21天后基本恢复正常与C组无统计学差异；同侧热痛(R)阈值第1天两组增高,C组在第3天恢复正常,第5天至第21天表现出相对组S更高的热痛阈值,S组热痛阈值稍高于基础值,21天后两组同侧后足对热刺激均无统计学差异(p>0.05)。S组和C组对侧(L)术后均表现出机械痛,均在第3天达到峰值,C组除外第3天,其余时点机械痛阈值与基础值比较无差异,而S组机械痛阈值均比较C组低(p<0.05)。S组热痛也表现增高的趋势,术后第1天和术后第14天高于C组,其余时点,两组无统计学差异(P>0.05)。术后第3-5天,两组均首次表现出对热痛的敏感,S组阈值低于C组,第7天后(除外第14天),两组差异不显著(P>0.05)。尼氏染色并未显示隐神经具有水肿和变性。应用软件Gel-Pro Analyser进行灰度面积统计,双侧的急性期灰度值分别是(9110.45±135.21)和(8900.54±200.21),有统计学差异,P<0.05。慢性期灰度面积分别为(9210.45±155.56)和(9000.54±312.38)组间比较,无统计学差异,P>0.05。电子显微镜下(8000X)观测到的隐神经的形态学计数资料显示有髓轴突和C纤维密度并没有因为牵拉而发生改变。有髓轴突的密度和C纤维的密度,S组在各时点与C组比较,组间没有差异,P>0.05(t检验)。慢性期和急性期S组椭圆形微管密度在神经牵拉后在有髓轴突内和C纤维内增加,比较C组明显增加(P<0.05),而2组中圆形微管则无显著性差异(P>0.05)。含有异常线粒体的有髓轴突的比例在急性期S组高于C组(对照组),在慢性期异常线粒体的比例仍然比较对照组增高,但是C纤维中的线粒体的增加组间比较具有统计学差异(P<0.05)。神经元内异常线粒体的数量(no./视野)分别在0天、术后3天和术后28天取材后进行观察,术后3天和术后28天,异常线粒体数目S组明显高于组C,组间比较,P<0.05。异常线粒体数目与溶酶体数目的表现基本一致。S组内质网在神经牵拉后的第3天,表现为内质网水肿样的间隙增大增宽,第28天,水肿样改变并没有改善。C组并未明显见到内质网的间隙增大增宽的病理性改变。施万细胞(schwann,又名雪旺细胞)和卫星细胞(GFAP)在急性期的活化比例增多,慢性期减少,且免疫荧光显示急性期表达比例高,慢性期表达量少。小胶质细胞的标记物(OX-42),小胶质细胞在神经被牵拉后的同侧急性期大量活化,慢性期第28天活化程度大幅回落。第二部分我们研究数据证实外周神经周围给予右美托咪定复合罗哌卡因,能明显改善SMIR模型急性期的机械痛且疼痛的达峰时间延迟。复合剂量的用药组热痛的阈值升高。而且异常线粒体的数量在低剂量DEX复合罗哌卡因组(1μg复合0.5%右美托咪定)明显低于其他3组。第三部分本研究结果提示S组、R组和RD1组同侧机械痛的阈值在第3天从基础值各自下降至4.52±0.667 g,5.827±0.732g,11.88±0.223g,对侧后足各组的机械痛阈值从基础值下降至7.10±0.91g,17.687±1.9g,16.213±1.8g。免疫荧光结果显示第3天,3组胶质细胞的激活双侧均出现,第28天胶质细胞活性均下降。组间比较,R组和S组的同侧胶质细胞活性最强,以表达OX-42抗体阳性细胞为主,GFAP阳性细胞的活性相对弱。高倍电镜的观测结果显示,肿胀和空泡样变的线粒体和溶酶体的数目在S组和R组的同侧明显多于对侧,但在RD1组,可见肿胀和空泡样变的线粒体和溶酶体的数目明显减少。结论第一部分结论本次研究所探讨的外周神经牵拉后,其损伤效应是多因素参与的结果。外周神经被牵拉,线粒体内质网在应激状态下分别表现为水肿样和空泡样改变,微管在线粒体或内质网的变化刺激下倾斜率增加,伴随小胶质细胞、卫细胞和施万细胞相继被活化。随着疼痛症状的减轻,上述的病理改变也相应改善。异常线粒体与疼痛的关系可能与轴突受损伤后密切相关。因此疼痛的症状和线粒体的改变可能是神经受刺激后的早期征兆。第二部分我们的研究结果提示异常线粒体可能是急性疼痛和术后持续性疼痛的原因。恰当剂量的局部应用右美托咪定复合罗哌卡因能改善镇痛效果并减轻术后疼痛。第三部分局部注射右美托咪定和罗哌卡因能抑制抑制胶质细胞的活化并能抑制双侧DRG的超微结构的改变,从而减少MIP的发生。