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重金属污染是土壤最主要的污染,其中镉(Cd)是当前中国土地污染中污染最广的重金属。镉通过食物链进入人体并长期在肝和肾等器官中积累,导致肺癌和肾衰竭的发生,土壤镉污染危害了粮食安全并成为了日益严峻的环境问题。植物修复是利用植物自身具有的吸附土壤中重金属并转运至易被收割的地上部分组织中,以减少土壤中的重金属的方法,目前已成为修复土壤Cd污染的研究热点方向。当前已发现的具有植物修复能力的植物品种往往具有生物量较小的特点,从而严重限制了植物修复的效率。烟草(Nicotiana tabacum L.)具有生物量大、生长迅速、环境适应性强等诸多优点,是潜在的修复土壤重金属污染土壤的高效作物。植物修复植物要求植物具有将重金属从根转移至地上部分的强转运能力,植物中的自然抵抗相关的宏蛋白(Natural resistance associated macrophage protein,Nramp)是一类在植物中参与金属离子转运的基因家族,如水稻、拟南芥等植物中部分Nramp蛋白已被证实具有将Fe、Mn、Zn、Cd等金属由根转运至地上部分的能力。因此通过分子生物技术研究NtNramp5影响Cd在烟草中积累的分子机制将促进土壤环境安全和食品安全领域的进步。本文以烟草TN90为材料,NtNramp5为研究对象,Cd积累机制为目标主要进行了以下研究:1.烟草对Cd胁迫的生理生化响应机制本文为验证TN90对Cd胁迫的生理生化响应的机制,主要进行了Cd胁迫下烟草TN90发芽率实验、根长统计、地上部分和根Cd含量检测、叶绿素含量、脯氨酸含量、丙二醛含量、过氧化物酶活性等指标的测定。结果显示:Cd胁迫随浓度升高会显著降低烟草种子萌发率;团棵期烟草根在10μM、20μM、50μM Cd胁迫胁迫下根长分别下降20.6%、29.7%、50.1%;叶绿素含量降低22.9%、42%和62%;地上部分脯氨酸含量随Cd胁迫而迅速升高6.9、8.3、9.4倍;过氧化物酶活性和丙二醛含量虽然会随Cd胁迫而变化,但并没有显著性差异。表明Cd胁迫对烟草生理生化最直接的影响就是根长变短、叶绿素含量下降和脯氨酸含量升高。测定Cd胁迫7天的烟草组织Cd含量显示,TN90满足Cd超富集植物Cd吸附量达到干重100μg/g以上,转移系数(TF)和生物富集系数(BCF)均大于1的标准,因此TN90是一种理想的有植物修复潜力的超富集Cd植物。2.NtNramp基因家族生物信息学和表达水平分析在筛选具有吸收或转运Cd能力的NtNramp家族成员上,我们认为其应具有以下特点:一是与Cd转运子水稻OsNramp1和OsNramp5在结构和功能上相似,二是应当主要在根中表达,三是可能受Cd诱导产生表达水平变化。通过进化树分析、Motif分析、数字表达谱分析、组织表达谱分析和诱导表达谱分析发现NtNramp5同时具有全部以上三点特点,因此NtNramp5成为研究Cd在烟草中积累的分子机制的目标基因。分别对烟草进行缺Fe、缺Mn、缺Zn诱导,NtNramp表达水平变化表明:所有NtNramp家族成员都对Fe缺乏诱导表现出表达水平升高,其中NtNramp3和NtNramp5表达水平都上升了2倍以上,暗示其可能是主要参与Fe转运的成员。3.NtNramp5超表达与烟草积累Cd的关系通过在烟草中超表达NtNramp5发现测定转基因超表达NtNramp5阳性苗Cd含量,结果显示叶片中Cd含量较非转基因烟草叶片有显著性提高,暗示NtNramp5参与了Cd的转运过程。此外Cd胁迫对超表达NtNramp5烟草转运更多Fe起到了促进作用,暗示NtNramp5可能是Fe的转运子,与前文的推测相吻合。同时叶片测定Mn和Zn含量的结果显示没有显著性差异表明Cd胁迫对转基因烟草转运Mn和Zn可能无关。