论文部分内容阅读
目的:探讨肽聚糖识别蛋白1(peptidoglycan recognition protein 1,PGLYRP-1)抗鼠衣原体(Chlamydia muridarum,Cm)小鼠生殖道感染的作用及效果。方法:PCR技术扩增PGLYRP-1基因,构建pET-28a(+)/PGLYRP-1原核表达质粒。经测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达PGLYRP-1重组蛋白,Ni2+-NTA对重组蛋白进行纯化,Western blot鉴定;BCA法测定PGLYRP-1重组蛋白的浓度;多粘菌素B去除重组蛋白的内毒素。选取6-8周龄BALB/c小鼠,注射甲羟孕酮2.5mg,同步小鼠体内雌激素。1周后,分为三组:第一组为阴性对照,注射等体积PBS;第二组为PGLYRP-1蛋白抗感染组,以5.0×105 IFUs的Cm接种于小鼠阴道后穹隆,剂量为15μL/只,感染后的第7d和第10d,分别取25μL剂量为50μg、100μg、200μg的PGLYRP-1蛋白注射至抗感染组小鼠阴道后穹隆;第三组感染Cm作为阳性对照,即用5.0×105IFUs的Cm接种于小鼠阴道后穹隆,剂量为15μL/只。分别在Cm感染后3d、7d、10d、14d、21d、28d、35d用棉签拭子收集抗感染组和阳性对照组小鼠生殖道分泌物并进行培养,间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)测定包涵体数量。感染Cm后第21d,脱颈处死小鼠,无菌取小鼠的输卵管,ELISA法检测输卵管匀浆组织上清中细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ表达水平。感染Cm后第63d,分离小鼠的输卵管组织进行苏木素-伊红(H&E)染色,评估其病理变化。结果:1.pET-28a(+)/PGLYRP-1重组质粒转化菌经诱导后表达分子量约24 kDa的PGLYRP-1重组蛋白。2.小鼠生殖道感染Cm后,对3d、7d、10d、14d、21d、28d、35d的小鼠生殖道分泌物进行包涵体计数,阳性对照组包涵体数量分别为(10.8±0.80)×104、(1.0±0.96)×104、(1.2±1.00)×103、(4.0±0.50)×102、(1.2±0.25)×102、(4.0±0.08)×10、第35d未检出;50μg PGLYRP-1蛋白抗感染组包涵体计数分别为:(9.8±0.72)×104、(8.0±0.82)×103、(5.0±0.24)×102、(4.0±0.80)×10、第21d之后均未检出;100μg PGLYRP-1蛋白抗感染组包涵体计数分别为:(9.6±0.84)×104、(2.5±0.60)×103、(2.2±0.64)×102、第14d后均未检出;200μg PGLYRP-1蛋白抗感染组包涵体计数分别为:(8.8±0.49)×104、(4.2±0.88)×102、第10d后均未检出(图5B)。与对照组相比,蛋白抗感染组小鼠对Cm生殖道感染的清除加快。其清除速率与PGLYRP-1蛋白注射浓度呈正相关。3.在第63d处死小鼠,检查小鼠输卵管病变。Cm感染组6只中有5只(5/6)存在单侧或双侧积水现象,病变率达到83.33%,而PGLYRP-1蛋白抗感染组9只中有2只(2/9)存在单侧或双侧积水现象,病变率仅为22.22%。在制备的H&E切片,显微镜放大40倍时,对小鼠两侧壁和输卵管腔进行炎症积分计数。与PBS对照组相比,阳性对照组小鼠输卵管组织出现明显的管腔内不规则扩张和炎性细胞浸润;与阳性对照组相比,蛋白抗感染组小鼠输卵管积水、输卵管扩张程度和炎症程度明显减轻,其减轻程度与PGLYRP-1蛋白含量呈正比。4.Cm感染21d后,制备输卵管组织匀浆,收集上清测定细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ含量。IL-2表达水平如下:PBS组为8.24±0.15pg/mL;蛋白抗感染组分别为:8.68±0.67pg/mL、9.03±0.38pg/mL、9.44±0.76pg/mL;Cm阳性组为8.52±1.29pg/mL;各组间IL-2表达差异无统计学意义(P>0.05)。IL-4表达水平如下:PBS组为2.21±0.50pg/mL;蛋白抗感染组为:11.73±1.38pg/mL、15.56±0.92pg/mL、20.00±1.84pg/mL;阳性组为12.42±0.86 pg/mL;蛋白抗感染组和阳性对照组IL-4表达增加(P<0.05);100μg和200μg蛋白抗感染组IL-4表达水平高于阳性对照组(P<0.05),其表达水平与PGLYRP-1浓度呈正相关。IFN-γ表达水平如下:PBS组为14.02±2.33pg/mL;蛋白抗感染组为65.41±2.54pg/mL、117.57±8.55pg/mL、143.23±9.67pg/mL;阳性对照组为89.77±3.96 pg/mL;蛋白抗感染组和阳性对照组IFN-γ表达增加(P<0.05);100μg和200μg蛋白抗感染组IFN-γ表达水平高于阳性对照组(P<0.05),其表达水平与PGLYRP-1浓度呈正相关。结论:PGLYRP-1具有抗小鼠生殖道Cm感染的作用。