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肿瘤的发生及转移是一个复杂、多步骤的连续过程,免疫系统作为机体的防御体系,可有效的识别“自我”和“异源”物质,并通过适应性免疫或获得性免疫应答途径杀伤和清除“异物”。肿瘤细胞在发生发展过程中可表达多种异源性抗原,但肿瘤患者的免疫系统往往未能有效的识别这些抗原并清除肿瘤细胞,导致肿瘤细胞在免疫监视状态下仍能实现迁移和侵袭,这也就提示肿瘤细胞可通过某种方式逃避免疫系统的监视[1]。肿瘤实体是一复杂的开放系统,除肿瘤细胞外,还包含有间质细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、肿瘤局部浸润免疫细胞等大量的非肿瘤细胞,它们与细胞外基质共同构成了肿瘤微环境。肿瘤微环境作为免疫系统与肿瘤细胞正面交锋的主场所,免疫逃逸作为肿瘤恶化进展的重要机制,目前普遍认为微环境改变是肿瘤细胞免疫逃逸的关键因素。癌症进展过程中,肿瘤细胞则可利用免疫检查点躲避免疫系统的监视和控制实现免疫逃逸。因此明确免疫检查点在肿瘤微环境中的可能作用,通过阻断免疫抑制因子传递以改善肿瘤免疫微环境,恢复内源性抗肿瘤免疫效应成为目前肿瘤预防及治疗研究热点。程序性死亡受体1(programmed cell death receptor 1,PD-1,CD279)作为一类重要的免疫抑制分子,它们在机体的适应性免疫抵抗中发挥着重要作用,目前普遍认为PD-1及其配体PD-L1是肿瘤免疫逃逸机制的核心调控分子,在多种肿瘤如黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌、甲状腺癌、卵巢癌及胰腺癌的实体组织均可检测到PD-L1的高表达,且PD-Ll蛋白的表达水平与肿瘤患者的临床病理特征及预后密切相关。鉴于PD-1/PD-L1信号通路在肿瘤进展中的重要作用,通过特异性抗体阻断PD-1/PD-L1信号以获得持续的阻滞效果实现对机体免疫应答效应的恢复,已成为晚期肿瘤个体化治疗研究主导方向。肿瘤的治疗方案主要釆用手术、放疗、化疗等综合手段,化疗作为一种适用于全身的治疗方法,在肿瘤的治疗中有着广泛的应用,但长期使用化疗药物引发的抵抗作用可降低药物的疗效导致患者的预后不佳,因此耐药问题已成为目前肿瘤治疗过程中的巨大障碍。近年来研究显示化疗药物不只是一种纯粹的细胞毒性药物,其对肿瘤微环境免疫效应的形成也具有明确的调控作用,这也就提示多种免疫调控分子可能也参与了化疗药物耐药机制。PD-1/PD-L1通路作为肿瘤微环境免疫调控的关键控制点,报道称给予肿瘤细胞化疗药物干预后可促进PD-L1表达,但目前对其具体的调控机制尚未明确。INF-γ作为一种多功能细胞因子,是抗感染、抗肿瘤免疫反应等多个生物学事件的关键调控因子。以往普遍认为INF-γ可增强NK细胞及T细胞活性,促进Th1型细胞因子的分泌,具有促进抗肿瘤免疫途径活化作用。但近期研究发现高浓度或持续低剂量INF-γ刺激可诱导肿瘤免疫逃逸微环境的形成,提示INF-γ对肿瘤的调控作用可能具有多面性,后续研究显示INF-γ可促进PD-L1的活化,由此我们推测PD-L1在化疗耐药中的活化途径可能是通过INF-γ介导实现,因此为了证实该推论,本研究中我们构建胃癌及肝细胞癌5-FU耐药细胞株,分析耐药细胞株中PD-L1表达变化,并利用转染过表达及si RNA干预手段探讨PD-L1在5-FU耐药机制中的可能作用,同时给予耐药细胞株不同浓度的INF-γ刺激分析PD-L1表达情况及细胞的生物学功能,以期通过调控INF-γ与PD-L1逆转肿瘤化疗耐药,提高化疗疗效,改善患者的预后。方法:1)MTT法检测胃癌细胞SGC7901对5-FU敏感性,依据细胞生长状态逐渐提高5-FU浓度诱导建立胃癌SGC7901/5-FU耐药细胞株,MTT法检测不同浓度5-Fu处理后SGC7901/5-FU耐药细胞株及亲本细胞株细胞活性变化,Western Blot法分析SGC7901/5-FU耐药细胞株及亲本细胞株PD-L1表达水平;2)MTT法检测肝细胞癌细胞BEL-7402对5-FU敏感性,将BEL-7402细胞置于含有1μg/m L 5-FU培养液中培养,依据细胞生长状态逐渐提高5-FU浓度诱导建立BEL-7402/5-FU耐药细胞株,MTT法检测不同浓度5-Fu处理后BEL-7402/5-FU耐药细胞株及亲本细胞株细胞活性变化,Western Blot法分析BEL-7402/5-FU耐药细胞株及亲本细胞株PD-L1表达水平;3)构建pc DNA3.1(+)/PD-L1真核表达重组质粒及PD-L1 si RNA慢病毒载体,转染后获得PD-L1过表达及干扰耐药细胞,免疫荧光法验证转染或干扰效果,MTT法检测PD-L1过表达及干扰耐药细胞对5-FU敏感性,流式细胞仪分析细胞凋亡率,Western Blot法检测细胞中PD-L1、ABCC1和Bcl-2表达水平;4)亲本及5-Fu耐药BEL-7402细胞,分别给予不同浓度IFN-γ(0μg/L、5μg/L、10μg/L及20μg/L)及5-FU(20μg/m L)干预后,MTT法检测IFN-γ刺激后耐药细胞对5-FU敏感性,流式细胞仪分析细胞凋亡率,Western Blot法检测细胞中PD-L1、JAK、p-JAK、STAT3及p-STAT3表达水平;转染PD-L1 si RNA慢病毒载体构建PD-L1干扰耐药细胞株,给予IFN-γ(10μg/L)及5-FU(20μg/m L)干预后,MTT法检测细胞活力变化。结果:1)SGC-7901细胞及BEL-7402细胞的IC50分别为2.2μg/m L和21.47μg/m L,反复大剂量冲击结合逐步递增5-FU药物浓度诱导SGC-7901及BEL-7402耐药细胞株IC50分别为8.16μg/m L和237.56μg/m L,提示耐药细胞株构建成功。2)MTT法检测SGC-7901和BEL-7402细胞增殖活性,5-FU干预条件下,SGC-7901/5-FU和BEL-7402/5-FU细胞活力显著高于亲本细胞。3)与亲本细胞相比,肝细胞癌及胃癌耐药细胞PD-L1表达水平均表现为不同程度的升高,提示PD-L1可能参与了肝细胞癌及胃癌5-FU耐药性机制。4)将pc DNA3.1(+)PD-L1质粒转染至SGC7901及BEL-7402耐药细胞株,建立PD-L1过表达胃癌及肝细胞癌耐药细胞,同时转染pc DNA3.1(+)空载体(p Vector)作为对照组,培养24 h后收集细胞,可见pc DNA3.1(+)PD-L1质粒转染SGC7901及BEL-7402耐药细胞组内PD-L1表达水平明显高于p Vector组。免疫荧光结果显示,PD-L1主要表达于细胞膜,且过表达组细胞PD-L1荧光强度明显高于p Vector组。5)1μg/m L 5-FU干预条件下,SGC7901/5-FU+p Vector组细胞抑制率为(37.23±0.15)%,SGC7901/5-FU+PD-L1组细胞抑制率为(16.41±0.22)%,SGC7901/5-FU+PD-L1组细胞抑制率明显低于SGC7901/5-FU+p Vector组;给予BEL-7402/5-FU+p Vector和BEL-7402/5-FU+PD-L1组细胞5μg/m L 5-FU干预后,可见BEL-7402/5-FU+p Vector组细胞抑制率为(3.15±0.11)%,BEL-7402/5-FU+PD-L1组细胞抑制率为(0.56±0.08)%,相同浓度5-FU对BEL-7402/5-FU+PD-L1组细胞抑制率明显低于BEL-7402/5-FU+p Vector组;伴随5-FU干预剂量的增加,各组细胞抑制率也表现为递增的趋势,但5-FU对p Vector转染组细胞抑制率均高于PD-L1转染组,提示过表达PD-L1可下调SGC7901/5-FU及BEL-7402/5-FU细胞对5-FU敏感性。6)与p Vector对照组相比,SGC7901/5-FU+PD-L1组细胞凋亡率显著降低,提示过表达PD-L1可抑制5-FU对胃癌细胞的促凋亡作用。7)慢病毒转染后Western Blot法分析SGC7901/5-FU及BEL-7402/5-FU细胞PD-L1蛋白表达量,结果显示PD-L1 si RNA组中PD-L1蛋白表达量明显低于对照组,表明si RNA干扰后成功下调SGC7901/5-FU及BEL-7402/5-FU细胞PD-L1蛋白表达量。8)与对照组相比,SGC7901/5-FU及BEL-7402/5-FU si RNA干扰组细胞活力显著降低,表明下调细胞PD-L1表达可增强5-FU对SGC7901/5-FU及BEL-7402/5-FU细胞抑制作用。9)与对照组相比,SGC7901/5-FU+PD-L1 si RNA组细胞凋亡率显著升高,提示PD-L1表达抑制可辅助增强5-FU对胃癌细胞的促凋亡作用。10)ABCC1作为ABC转运蛋白超家族成员,它可通过介导细胞内药物排出、改变药物在细胞内分布引发肿瘤耐药。Bcl-2具有凋亡抑制作用,研究认为其与凋亡拮抗耐药途径密切相关。结果显示PD-L1表达水平的改变可影响耐药细胞中ABCC1和Bcl-2表达量,表现为PD-L1过表达时可促进细胞内ABCC1和Bcl-2蛋白表达量,而PD-L1表达干扰时ABCC1和Bcl-2表达水平也呈现下调趋势,提示PD-L1可能通过调控ABCC1及Bcl-2蛋白表达水平参与肿瘤耐药过程。11)取对数生长期BEL-7402/5-FU细胞,分别给予不同浓度IFN-γ(0μg/L、5μg/L、10μg/L及20μg/L)及5-FU(20μg/m L)干预,MTT法检测BEL-7402/5-FU增殖变化,结果显示给予IFN-γ干预后,5-FU对BEL-7402/5-FU细胞抑制作用明显减弱,随着IFN-γ剂量的增加,5-FU对BEL-7402/5-FU抑制作用也不断降低,提示IFN-γ干预后可提高BEL-7402/5-FU细胞活力,增强其对5-FU的耐药力。12)与对照组相比,IFN-γ干预组BEL-7402/5-FU细胞凋亡率显著降低,且存在量效关系,提示IFN-γ干预后可拮抗5-FU的促凋亡作用。与对照组相比,IFN-γ干预组中PD-L1表达水平显著增加,且与IFN-γ作用剂量相关。13)Western-blot法检测各组细胞JAK、p-JAK、STAT3及p-STAT3表达水平,与对照组相比,IFN-γ干预组中JAK及STAT3磷酸化程度显著增加,且与IFN-γ作用剂量相关,提示IFN-γ干预后可激活JAK/STAT3途径。14)PD-L1 si RNA慢病毒感染BEL-7402/5-FU细胞,给予IFN-γ(10μg/L)和5-FU(20μg/m L)干预24 h,MTT法检测各组细胞存活情况,结果显示PD-L1si RNA干扰后,IFN-γ+5-FU干预组BEL-7402/5-FU细胞活力与未转染组相比显著降低,提示PD-L1表达抑制可影响IFN-γ对5-FU的拮抗作用,提高BEL-7402/5-FU细胞对5-FU敏感性。结论:1)本研究采用反复大剂量冲击结合逐步递增5-FU药物浓度诱发成功建立胃癌SGC-7901及肝细胞癌BEL-7402 5-FU耐药细胞株,与亲本细胞相比SGC-7901和BEL-7402耐药细胞株对5-FU抵抗能力明显增强。2)肝细胞癌及胃癌耐药细胞PD-L1表达水平均表现为不同程度的升高,提示PD-L1可能参与了肝细胞癌及胃癌5-FU耐药性机制。3)本研究成功构建PD-L1过表达及干扰耐药细胞,证实PD-L1过表达可提高SGC7901/5-FU及BEL-7402/5-FU细胞对5-FU的耐药性,抑制细胞的凋亡;PD-L1表达干扰则可增强SGC7901/5-FU及BEL-7402/5-FU细胞对5-FU的敏感性。4)PD-L1与肝细胞癌及胃癌5-FU的耐药机制密切相关,抑制其表达可改善耐药细胞对5-FU敏感性。5)PD-L1对胃癌5-FU耐药机制的调控作用是通过上调ABCC1和Bcl-2实现的。6)IFN-γ可降低耐药细胞对5-FU的敏感性,表现为细胞活性的增强及凋亡抑制。7)IFN-γ可通过启动JAK/STAT-3通路促进耐药细胞PD-L1表达,提示肿瘤耐药性可能与微环境中IFN-γ调控作用有关。