实验目的：　　 通过MENK作用于骨髓来源树突状细胞(BMDCs)的体外实验，荷瘤小鼠CD8+T细胞的体内、外实验研究，探讨MENK对CD8+T细胞抗肿瘤免疫应答效应及相关作用机制。　　 实验方法：　　 1、MENK体外调控抗原负载BMDCs实验研究　　 采用4-6周C57BL/6小鼠，取骨髓，诱导BMDCs。应用扫描电镜技术观察BMDCs形态;应用流式细胞分析技术定量检测BMDCs表面关键分子CD40，CD86和CD83表达;应用酶联免疫吸附技术(ELISA)检测BMDCs分泌IL-12和TNF-α;应用MTS方法检测CD8+T细胞增殖;应用流式细胞分析技术定量检测CD8+T细胞多种功能分子CD28，perforin(Prf)和FasL的表达;应用MTS方法检测CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤。　　 2、MEN对CD8+T细胞表型功能及相关信号转导通路的影响　　 采用4-6周C57BL/6小鼠，皮下注射S180骨肉瘤细胞，制备荷瘤小鼠动物模型。体内外环境下分别给予不同实验组MENK及MENK+阻断剂纳洛酮(Naltrexone，NTX)，进行实验研究。应用流式细胞分析技术定量检测CD8+T细胞多种功能分子CD3，CD8，CD28，CD152，Prf, granzymeB(GrzB)及FasL的表达;应用ELISPOT技术检测体外实验中CD8+T细胞IFN-γ的表达含量;应用Western Blot及免疫荧光技术检测CD8+T细胞膜表面阿片受体MOR及DOR的表达;应用流式细胞分析技术及免疫荧光技术检测CD8+T细胞胞浆内钙离子的浓度变化;应用Western Blot及免疫荧光技术检测CD8+T细胞T细胞活化转录因子(NFATs)的表达。　　 实验结果：　　 一、MENK可促进负载肿瘤抗原BMDCs成熟并增强其上调CD8+T的细胞功能　　 1、MENK可有效促进负载肿瘤抗原BMDCs成熟，提高其抗原递呈能力;MENK+肿瘤抗原负载组树突状细胞表面膜分子CD40，CD86和CD83表达明显上调，IL-12及TNF-α的量显著增加，上述作用可被NTX阻断。　　 2、MENK负载肿瘤抗原BMDCs可显著增强CD8+T细胞的活性及杀伤功能。　　 二、MENK可直接激活CD8+T细胞并促进CTL对肿瘤细胞的杀伤　　 1、MENK可促进CD8+T细胞增殖;MENK可上调CD28，CD152，Prf, GrzB和FasL等多项CD8+T细胞活化分子;体外实验中，MENK可显著上调荷瘤小鼠CD8+T细胞分泌IFN-γ的含量，上述作用可被NTX阻断。　　 2、CD8+T细胞表面有阿片受体MOR及DOR的表达;MENK可上调荷瘤小鼠CD8+T细胞阿片受体的表达，上述作用可被NTX阻断。　　 3、MENK可显著上调荷瘤小鼠CD8+T细胞胞浆钙离子浓度:体内外实验中，淋巴结CD8+T细胞胞浆钙离子浓度均显著高于对照组;MENK可上调荷瘤小鼠CD8+T细胞NFAT2表达及活化核转移，上述作用可被NTX阻断。　　 4、体外培养经MENK活化的淋巴结来源的CD8+T细胞可经眼底静脉回输途径有效到达小鼠肿瘤部位，并进一步正向调节荷瘤小鼠细胞免疫功能，杀伤肿瘤细胞，荷瘤小鼠存活率显著高于对照组。　　 结论：　　 1、MENK可上调负载肿瘤抗原的BMDCs的表型及功能并正向调节CD8+T细胞的活性及杀伤功能。　　 2、MENK可直接促进CD8+T细胞的增殖，有效转化为效应毒性T细胞(CTL)，杀伤S180肿瘤细胞。　　 3、MENK可通过与CD8+T细胞表面阿片受体结合，上调CD8+T细胞阿片受体的表达及细胞内钙离子浓度，进而引起胞浆内NFAT2去磷酸化后变为活化形式入核，上调CTL分泌IFN-γ含量，增强CTL的细胞毒活性及特异性杀伤肿瘤作用。　　 4、MENK处理后CD8+T细胞回输荷瘤小鼠，可有效抑制荷瘤小鼠肿瘤生长，提高荷瘤小鼠的生存率。