背景:食管癌是最常见的癌症之一,起源于食管粘膜上皮。食管癌发病率排名全球第五至第八而死亡率则为第四到第六。而在中国,这种情况更为严重,每年有二十万人死于食管癌。【1-3】肿瘤的发生、发展与各种癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相关。而这些相关基因及蛋白的失衡直接影响细胞的增殖、分化、凋亡、衰老。转录因子Miz-1(Myc-interacting zinc finger protein 1;Zbtb17,Myc结合锌指蛋白)可以与相关蛋白结合激活或抑制下游基因及蛋白的表达,从而发挥生物学活性。原癌基因蛋白Myc就其重要的结合物之一。其编码的抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂如cdkn2b(p15)和cdkn1a(p21)是熟知的两种抑癌蛋白,可以影响细胞周期从而抑制癌细胞无限繁殖。本研究通过慢病毒作为载体建立敲减Miz-1目的基因及其编码蛋白的食管癌细胞株。通过对目的转染细胞株的观察来探讨目的基因生物学活性。同时观测细胞生物学相关蛋白的表达,探讨目的基因Miz-1作用的信号通路和作用方式,可望为食管癌基因治疗方面提供可选的靶点,为食管癌的临床治疗提供理论基础与新的治疗方式。目的:通过RNAi干扰技术,利用慢病毒将目的基因相关的特异性的sh RNA转录入细胞筛选出两种不同的食管癌细胞系,构建敲除低表达Miz-1目的基因的目标食管癌细胞株。从而探究Miz-1对于食管癌细胞株Eca109及Kys-150细胞增殖、凋亡、周期、迁移、侵袭的生物学行为的影响。通过检测相关蛋白表达,探讨Miz-1可能参与发挥生物学功能的机制及参与作用的信号通路。为进一步研究Miz-1在食管癌发生发展及食管癌临床基因靶向治疗提供一定的理论基础及依据。方法:1.通过委托上海英为信生物科技有限公司构建针对目标基因Miz-1构建sh RNA慢病毒载体,通过筛选七种不同的食管癌细胞系,选取两种为目标细胞系进行转染,构建两种低表达Miz-1蛋白的食管癌细胞株。每种细胞株分为目标基因Miz-1sh RNA转染组(Miz-1)、转染空载体组(vector)、空白对照组(control)。2.采用RT-PCR及免疫组化技术检测食管癌组织及癌旁组织Miz-1在基因和蛋白层面的差异性表达。3.采用RT-PCR筛选待转染的目标食管癌细胞系。4.采用荧光、RT-PCR和Western blot技术验证目标基因的低表达,同时运用后两种方法检测相关蛋白及基因的表达量。5.采用CCK8及克隆形成实验检测各分组细胞增殖分裂能力。6.采用流式细胞仪检测各分组细胞细胞周期及细胞凋亡情况。7.通过transwell小室检测各分组细胞的迁移和侵袭能力。8.SPSS17.0统计软件对上述实验方法所得数据进行统计学分析。结果:1.Miz-1在食管癌及癌旁组织中存在差异性表达,且在癌组织中为表达较高。2.从七组待选食管癌细胞系中筛选的两种细胞株分别为Eca109和Kys-150。3.通过慢病毒作为载体成功将Miz-1特异性sh RNA转入食管癌细胞基因组中,从而构建低表达Miz-1的两种食管癌细胞株。4.检测周期相关蛋白发现抑癌蛋白p21在转染目的基因组中表达较高,cyclin D1在转染组表达则相反。凋亡相关蛋白Caspase-3和PARP皆在目的基因组中表达较高。5.CCK8和克隆形成实验结果表示:低表达Miz-1能抑制细胞增殖;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡结果显示:低表达Miz-1转染组凋亡增多且细胞周期停留在G0/G1期的细胞数量多于对照组;transwell迁移及侵袭实验结果提示:目的基因转染组细胞迁移及侵袭的能力均弱于转染空载体组和空白对照组。结论:本实验研究证实了Miz-1在食管癌组织及癌旁组织中表达存在一定的差异性,且在食管癌组织中表达量较高。由此可推测目的基因可能在食管癌的发生、发展中起到了推动作用。于是构建了目的基因Miz-1低表达的两种人源性食管癌细胞株Eca109和Kys-150。实验证实低表达的Miz-1可以通过对细胞周期限制,抑制食管癌细胞的增殖;影响凋亡相关蛋白表达促进凋亡;同时降低迁移和侵袭能力。我们结果得出Miz-1结合或者不结合Myc原癌蛋白,抑制下游p21抑癌蛋白的表达,从而解除了p21对cyclin D1的抑制,发挥生物学作用。而对于Miz-1与Myc是否结合发挥作用还需要在进一步的研究中探索,而发现的Miz-1作为一个癌基因的靶点,对其作用机制和效用的研究,可以为食管癌的临床诊断和治疗提供更多的选择方案。