论文部分内容阅读
目的:通过100dB SPL广带白噪声对6周龄雄性C57BL/6J小鼠单次暴露2小时,观察这种强度的噪声暴露对小鼠听觉功能损害的特点,并通过声诱发的惊跳反射及其前抑制试验明确耳鸣症状,以建立正常听力的耳鸣动物模型。探究这种噪声暴露后的C57BL/6J小鼠听觉神经通路中外周的内毛细胞带状突触数目以及中枢的神经递质含量的变化。部分噪声暴露组小鼠在10周龄时接受相同条件的二次暴露,观察其耳蜗电生理指标的变化以及对带状突触以及内外毛细胞形态和数量的影响。研究方法:选用SPF级6周龄雄性C57BL/6J健康小鼠,使用条件为100dB SPL的广带白噪声单次暴露2小时,观察这种强度的噪声暴露对小鼠的听觉功能损害的特点,并通过声诱发的惊跳反射及其前抑制试验评价其是否出现耳鸣症状。对照组小鼠不接受噪声暴露。每只实验动物分别于6周龄(噪声暴露后当日)、7、8、10、14周龄时接受ABR以及听觉行为检测。分析两组小鼠ABR的阈值、I波的幅值以及潜伏期;分析听觉行为试验ASR、NB-PPI以及GAP-PPI的数据。在各时间点分别处死小鼠,获取耳蜗、下丘及听觉皮层。行耳蜗基底膜铺片免疫荧光染色计数带状突触数量;下丘及听觉皮层制备组织匀浆,液相色谱仪检测谷氨酸和GABA的含量变化。部分噪声暴露组小鼠在10周龄时接受相同条件的二次暴露,观察其耳蜗电生理指标的变化以、对IHCs带状突触以及内外毛细胞形态数量的影响。分析多个样本均数差别的显著性检验采用单因素或双因素方差分析。结果:噪声暴露后当日,噪声暴露组听阈:4kHz(39±4.59 dB)、8kHz(26±3.16dB)、16kHz(21.5±5.79 dB)、32kHz(22.5±5.89 dB);同周龄对照组(6w):4kHz(31.5±5.29 dB)、8kHz(22±3.49 dB)、16kHz(16.5±3.37 dB)、32kHz(18±3.49 dB),组间对比差异具有统计学意义(P<0.05),噪声暴露后1周(7周龄):4kHz(31.5±3.37dB)、8kHz(22±4.22 dB)、16kHz(16.5±3.37 dB)、32kHz(18±2.58 dB);同周龄对照组(7w):4k Hz(31.5±3.37)、8kHz(22±4.22)、16kHz(16.5±3.37)、32kHz(18±2.58),组间对比差异无统计学意义(P>0.05)。继续观察8、10、14周龄在各个频率听阈结果,组间对比差异亦无统计学意义(P>0.05)。而80dB声刺激下ABR I波的幅值表现出了与听力下降相似的趋势,ABR I波的幅值在暴露后当日即出现显著下降(p<0.001),I波的幅值在暴露后1周和2周,与同周龄对照组小鼠相比,其差异仍然有统计学意义(p<0.05)。噪声暴露组各个时间点幅值分别为:6w(0.82±0.27 uv)、7w(0.98±0.39 uv)、8w(0.96±0.32 uv)、10w(0.97±0.34 uv)、14w(0.94±0.44 uv);对照组:6w(1.12±0.29 uv)、7w(1.12±0.30 uv)、8w(1.10±0.28uv)、10w(1.07±0.29 uv)、14w(0.99±0.28 uv)。80dB声刺激下ABR I波的潜伏期在两组间比较无显著差异。噪声暴露组小鼠惊跳幅值较同周龄对照组明显增加。在噪声暴露后2周(8周龄)和4周(10周龄)时小鼠惊跳反射幅值较对照组显著升高,8周龄时(p<0.05)而10周龄时组间差异更加显著(p<0.01)。惊跳幅值的升高集中在80、90、100dB SPL水平的刺激,其中90dB SPL声强刺激诱发的惊跳反射幅值差异最为显著(p<0.01),80、100dB SPL刺激下差异显著性(p<0.05)。以惊跳刺激的频率分析,小鼠在4k、8k、16k、32k所有四个频率的惊跳反射幅值均表现出明显升高(p<0.05),8kHz频率点差异最具有显著性(p<0.01)。对于NB-PPI,随着前抑制信号强度逐渐增强,噪声暴露组和对照组均表现出惊跳反射抑制的趋势,然而两组间的抑制率差异无统计学意义(p>0.05)。而且,噪声暴露后连续观察8周,并没有随着周龄增长而出现变化,组间差异无统计学意义(p>0.05)。对于GAP-PPI,在噪声暴露后第1周即表现出惊跳反射抑制率的明显下降,并一直持续到小鼠14周龄时(p<0.05)。在各个频率的窄带背景噪声下,经过噪声暴露的实验动物的惊跳反射抑制率明显低于对照组,中心频率在8kHz及16kHz时组间的统计学意义最为显著(p<0.001),32kHz时次之(p<0.01),4kHz时显著性最低(p<0.05)。激光共聚焦显微镜下观察耳蜗基底膜铺片免疫荧光染色,可见带状突触前膜结构CtBP2与突触后膜受体GluR2/3均特异性地表达于内毛细胞胞浆,且其分布不均匀,细胞基底部表达数量多而细胞核周围表达极少。两者在内毛细胞内部的表达呈现高度的共定位现象。暴露后当日内毛细胞内带状突触数量较同周龄对照组小鼠显著下降(p<0.001),噪声暴露后当日(6周龄)所有4个频率范围内的突触数量均出现下降,且差异具有统计学意义,其中16k、32kHz分布范围内带状突触数量下降更为显著(p<0.001),4k、8kHz分布范围内突触数量下降程度次之(p<0.01)。而在暴露后1周时,两组间差异已无统计学意义(p>0.05),而且持续观察至14周龄时带状突触数量无显著变化。液相色谱结果显示正常C57小鼠脑组织中GABA的含量在下丘中高于听皮层;Glu的含量听皮层高于下丘,其差异有统计学意义(p<0.001)。在初级听觉皮层中,噪声暴露组的兴奋性神经递质Glu在噪声暴露后当日以及暴露后2周相比对照组差异无统计学意义(p>0.05),在暴露后的第4周出现显著升高,其差异显著性(p<0.01),而到了暴露后8周时相比对照组两组间差异显著性进一步增大(p<0.001);听觉皮层中的抑制性神经递质GABA的含量则在噪声暴露后的各个时间点均保持稳定而且两组间差异不具有统计学意义(p>0.05)。在下丘中,兴奋性神经递质Glu的含量在噪声暴露后的各个时间点均保持稳定而且两组间差异不具有统计学意义(p>0.05);抑制性神经递质GABA的含量在噪声暴露后当日、暴露后2周以及4周相比对照组差异无统计学意义(p>0.05),而到了噪声暴露后第8周,相比对照组出现下降,组间差异具有统计学意义(p<0.05)。C57小鼠经历二次暴露后当日听阈上升更加显著(p<0.001),达到10dB左右,且在第14周龄时与对照组及单次噪声暴露组仍有非常显著的组间差异(p<0.001)。ABR I波幅值再次出现显著性下降,在各个频率间比较,8kHz声刺激下I波幅值下降显著性最低(p<0.05),其余各频率点(p<0.01)。14周龄时,各频率幅进一步下降(p<0.01),其中32k Hz差异最显著(p<0.001)。二次暴露当日突触数量再次显著下降(p<0.001),11、14周龄时与对照组相比仍然具有显著的统计学差异(p<0.001)。三组小鼠内外毛细胞形态及计数无统计学差异(p>0.05)。耳声发射结果组间差异无统计学意义(p>0.05)结论:(1)本次研究应用100dB SPL广带白噪声对6周龄雄性C57BL/6J小鼠暴露2小时,使实验动物在噪声暴露当日出现暂时性听力阈移,听力在随后一周恢复正常。而且,经过行为检测,实验动物表现出符合耳鸣相关症状的行为,成功建立无明显听力下降的耳鸣动物模型。(2)耳蜗基底膜IHCs的带状突触数量在噪声暴露当日即出现显著下降,即存在外周的传入神经阻滞,而因突触的可塑性,数量在随后的动态观察时间内可恢复至正常。(3)听觉中枢则表现出兴奋与抑制性神经递质的失衡,产生超兴奋性。为“耳蜗带状突触损伤-外周传入信号减弱-听觉中枢过度补偿-中枢超兴奋性产生-耳鸣发生”这一假说提供了证据。(4)二次暴露后造成了与第一次暴露不同的结果,耳蜗带状突触数量永久性减少,提示听觉神经可塑性的局限性。