[研究目的]细胞自噬是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性的降解途径,近年来研究发现,细胞自噬与凋亡通过内在的分子调控机制相互协调转化,与肿瘤发生密切相关。硒是具有抗癌作用的人体必需微量元素之一,大量证据表明,超营养剂量的硒能够诱导前列腺癌、肝癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、白血病等多种肿瘤细胞的凋亡。前期研究表明,20gM亚硒酸钠诱导人急性早幼粒白血病NB4细胞凋亡过程中,细胞自噬水平逐渐降低。并且,抑制自噬能够增加靶细胞的凋亡易感性。然而,硒在平衡调控细胞凋亡与自噬过程中所发挥的详细抗癌机制尚未完全阐明。本论文重点研究亚硒酸钠调控白血病细胞凋亡与自噬之间的转换机制,为硒应用于肿瘤的治疗和预防提供新思路。[研究方法]采用人白血病细胞株Jurkat和HL60作为实验材料。通过透射电镜、间接免疫荧光、流式细胞术等方法,从细胞形态学鉴定自噬的发生；应用Western blot和GFP-LC3融合蛋白质粒转染技术,从分子生物学水平检测细胞自噬水平的改变。通过AnnexinV/PI双染流式细胞术与CCK8细胞活力测定方法检测硒对细胞的凋亡诱导和生长抑制作用。通过实时定量自噬芯片技术筛查自噬发生过程中的差异表达基因,并进一步采用Western blot和RT-PCR方法加以验证。采用瞬时转染方法调整细胞内目的蛋白表达水平,或通过化学药物、功能特异质粒的转染改变目的蛋白活性,研究其在凋亡与自噬过程中发挥的作用；采用免疫共沉淀、GSTpull-down及免疫荧光共定位技术研究蛋白质之间的相互作用。采用染色质免疫沉淀技术分析相关转录因子对特定基因的转录调控。建立肿瘤细胞移植裸鼠模型,通过病理切片的免疫组化、流式细胞分选术和TUNEL等方法检测亚硒酸钠对异种移植瘤的凋亡诱导作用以及对肿瘤细胞侵润的抑制作用。[研究结果]用硒同时处理三株白血病细胞,NB4、Jurkat和HL60,发现亚硒酸钠激活了Jurkat和HL60细胞自噬的发生,即“自噬性死亡”,与NB4中被下调的细胞自噬截然相反。对不同株系细胞系进行比较及测序,我们推测p53是造成细胞间自噬表现差异的重要因素。1.实时定量自噬芯片技术鉴定出分子伴侣介导自噬过程中的重要调节因子热休克蛋白90(Hsp90)参与硒诱导的自噬与凋亡的差异调控,RNAi与过表达技术证明Hsp90在硒诱导的NB4细胞凋亡过程中发挥抗凋亡作用。通过免疫共沉淀,GST pull-down以及免疫荧光共定位技术,我们分别在体内外验证了Hsp90与IKK、p38MAPK和死亡相关蛋白激酶(Death associated protein kinase, DAPK)之间存在着直接的相互作用。2.检测硒处理后的三株细胞中IKK/NFκB通路,p38MAPK通路,DAPK通路等的激活情况发现：NB4细胞中Hsp90蛋白的表达下调特异地引起了IKK激酶的蛋白酶体途径降解与p38MAPK激酶的自磷酸化活化,引起细胞自噬下调；Jurkat细胞中IKK/NFκB通路与MKK3/6/p38MAPK通路同时被激活,细胞自噬上升；HL60细胞中硒主要通过Hsp90与PP2A分别稳定并参与DAPK的去磷酸化活化,介导亚硒酸钠引起细胞凋亡和自噬性死亡。我们分别对不同株系细胞中Hsp90介导的自噬凋亡调控的通路进行详细研究。3.对自噬相关基因的启动子及相关区域序列进行比对,并通过染色质免疫沉淀实验证明becnl基因第一个内含子中存在转录因子NFκB的潜在结合位点。亚硒酸钠通过Hsp90对下游IKK/NFκB通路的负调控,引起NB4细胞中自噬相关becnl基因转录水平的降低。Western blot方法检测Beclinl核心复合物成员Ambra-1、 Vps34、UVRAG的表达同样在硒处理后降低,表明Hsp90/NFkB/Beclin1在硒诱导的NB4细胞中,积极调控细胞自噬与细胞凋亡之间的平衡。4. p38MAPK信号通路促进亚硒酸钠诱导的凋亡,并对不同株系细胞自噬的发生起着不同的调控作用。NB4细胞中,UPR通路PERK/eIF2a/ATF4的激活,通过抑制Hsp90的表达释放p38MAPK激酶活性,将外界应激信号传递至下游转录因子ATF4; Jurkat细胞中,被MKK3/6激酶级联活化的p38MAPK,通过eIF4E引起ATF4的表达上调。ATF4平衡自噬相关mapllc3b基因与凋亡相关基因chop的转录,最终调控平衡细胞凋亡与自噬进程。5.NB4肿瘤移植裸鼠模型的建立,进一步从体内验证了亚硒酸钠具有潜在的诱导异种移植瘤的凋亡以及抑制肿瘤细胞侵润的抗肿瘤效应。[研究结论]本论文主要研究硒化合物在体内外的抗肿瘤效应,证明了Hsp90的受体蛋白IKK、p38MAPK和DAPK所参与的信号通路是亚硒酸钠平衡调控肿瘤细胞自噬与凋亡过程的重要机制。为逐渐完善小分子硒化合物的临床应用提供理论和实验依据,为系统揭示硒诱导白血病细胞自噬与凋亡转换调节网络奠定理论基础。