论文部分内容阅读
目的:牛磺酸(Taurine,Tau)是一种含硫氨基酸,能调节细胞渗透压,防止细胞内钙超载,减少自由基产生,改善细胞膜的通透性,防止细胞肿胀变形[1,2],是婴儿中枢神经系统发育期间的重要营养因子,有增强突触传递,缓解中风、癫痫、神经退行性疾病症状等神经保护作用[3,4]。Tau主要是由细胞膜上的牛磺酸转运体(solute carrier family 6 member 6,Slc6a6:序列参考号,NC-005103.4;taurine transporter,Tau T)转运至细胞内。为研究牛磺酸缺乏对神经系统疾病的影响,本研究利用CRISPR/Cas9技术构建并繁殖得到Tau T敲除大鼠(Tau T-/-),通过对该Tau T敲除大鼠的Slc6a6 m RNA和Tau T蛋白的表达情况及生理生化指标进行检测,为Tau T敲除大鼠模型的健康评估、药理药效实验研究提供一定的参考依据;并为研究牛磺酸缺乏对神经系统疾病的影响提供稳定的大鼠模型。方法:1.Tau T杂合子(Tau T+/-)首建大鼠的构建和鉴定:根据Slc6a6基因的第5外显子,利用CRISPR/Cas9技术构建特定的质粒表达载体,通过扩增、筛选、酶切、抽提纯化,体外转录,分别合成sg RNA和Cas9m RNA,通过显微注射,注入受精卵,经体外培养,再转入代孕母鼠体内。对首建大鼠进行基因型鉴定和测序分析,筛选F0代Tau T+/-首建大鼠(这部分实验是委托中国医学科学院医学实验动物研究所构建)。2.Tau T+/-大鼠的繁殖和鉴定:将F0代Tau T+/-大鼠与野生型SD大鼠合笼,得到F1代大鼠,经剪趾、提取DNA、鉴定,筛选出F1代Tau T+/-大鼠,并将其继续与野生型SD大鼠交配,扩增繁殖体系,再筛选出F2代Tau T+/-大鼠,令Tau T+/-大鼠再自交繁殖,得到F3代Tau T-/-(纯合子大鼠)、Tau T+/+(阴性大鼠)Tau T+/-(杂合子大鼠)。选取F3代大鼠进行以下实验。3.Tau T-/-大鼠大脑组织中Slc6a6基因和Tau T蛋白表达:提取Tau T-/-和Tau T+/+大鼠大脑组织总RNA和蛋白,通过Real-time PCR检测Slc6a6 m RNA的表达,通过Western blot实验和免疫组织化学方法检测Tau T蛋白的表达。4.Tau T-/-大鼠其它脏器中Slc6a6基因表达:用Real-time PCR检测Tau T-/-和Tau T+/+大鼠的心脏、肝脏、肾脏、骨骼肌中Slc6a6 m RNA的表达情况。5.Tau T-/-大鼠生理生化指标检测:观察1-6月龄F3代Tau T-/-大鼠和Tau T+/+大鼠的体重变化,检测16-20周龄Tau T-/-、Tau T+/-和Tau T+/+大鼠身长、尾长、体重及脏器的重量等生理指标,比较其脏器重量、脏器系数、脏脑比;抽取大鼠的血液,用全自动血液细胞分析仪检测30项血常规指标;用全自动生化分析仪分析23项血生化等指标。结果:1、Tau T+/-大鼠首建鼠的构建和鉴定结果:首次构建得到2只F0代Tau T+/-大鼠,杂合率18.2%。电泳鉴定:Tau T+/-大鼠的电泳结果显示两条电泳条带(702bp,312bp)。经测序证实,Tau T+/-大鼠电泳结果中的一条条带缺失了slc6a6的第5外显子。2、Tau T+/-大鼠繁殖结果:F0代和野生型SD大鼠交配得到4只F1代Tau T+/-,5只Tau T+/+;F2代有41只Tau T+/-,32只Tau T+/+;F3代包含29只Tau T-/-,69只Tau T+/-,34只Tau T+/+,F3代纯合率约为21.97%。繁殖期间,发现2只Tau T-/-大鼠有行动迟缓等表征,F0-F3代大鼠总体死亡率是6.22%。3、Tau T-/-大鼠的鉴定:Tau T-/-组大鼠包含一条条带312bp。Tau T+/-组大鼠包含两条电泳条带(702bp,312bp);Tau T+/+组大鼠包含一条条带(702bp),测序验证了F3代的Tau T+/-、Tau T-/-两种基因型大鼠缺失的序列和F0代缺失序列一致。4、Tau T-/-大鼠大脑组织中Slc6a6基因表达结果:与Tau T+/+大鼠比较,Tau T-/-大鼠脑组织Slc6a6 m RNA几乎不表达;Tau T-/-大鼠脑组织Tau T蛋白表达显著降低。5、Tau T-/-大鼠其它脏器中Slc6a6基因表达结果:在Tau T-/-组大鼠的心脏、肝脏、肾脏、骨骼肌中几乎不表达Slc6a6 m RNA,而且Tau T-/-组大鼠各脏器中Slc6a6m RNA的表达显著低于Tau T+/+组。6、Tau T-/-大鼠的生理生化指标的初步研究:(1)生理指标:16-20周龄雌性Tau T-/-大鼠的的体重、大脑、小脑、肝脏、肾脏等脏器重量显著低于雌性Tau T+/+组。雌性Tau T-/-大鼠的小脑、肾的重量显著低于Tau T+/-组。三种基因型大鼠的身长、尾长没有显著差异。雌性Tau T-/-组大鼠心的脏器系数显著高于Tau T+/+组,雌性Tau T+/-、Tau T-/-组肝脏的脏器系数显著低于Tau T+/+组。雌性Tau T-/-组心、肺的脏脑系数显著高于Tau T+/+组,雄性Tau T-/-组肾的脏脑系数显著低于Tau T+/-组。(2)血常规指标:与Tau T+/+组大鼠相比,Tau T-/-组大鼠嗜酸性粒细胞百分比偏低,嗜碱性粒细胞百分比、红细胞压积偏高。(3)血生化指标:与Tau T+/+组大鼠相比,Tau T-/-组大鼠的白蛋白偏低,碱性磷酸酶偏高。结论:1、本研究利用CRISPR/Cas9技术,定向敲除SD大鼠Slc6a6基因第5外显子首次建立Tau T+/-大鼠模型。2、通过繁殖和鉴定,成功建立了纯合子Tau T-/-大鼠模型,而且Tau T-/-大鼠不具有胚胎致死性。缺失基因能够稳定遗传:F3代Tau T-/-组大鼠DNA缺失序列和F0代一致;F3代Tau T-/-组大鼠脑、心脏、肝脏、肾脏、骨骼肌组织Slc6a6 m RNA表达显著降低,大脑组织中Tau T蛋白表达显著降低。3、Tau T-/-大鼠的生理生化检测结果表明:Tau T的缺乏会影响大鼠的白蛋白、碱性磷酸酶等生理生化指标含量;通过对体重、脏器系数和脏脑系数的比较,显示Tau T的缺乏导致大鼠的体重降低,并不同程度的影响雌性大鼠心脏、肝脏和肾脏的生长发育。4、本实验结果能为Tau T-/-大鼠的健康评估、药物毒理学实验等方面提供参照依据;Tau T-/-大鼠模型的建立,也为后期探究牛磺酸缺乏对神经系统疾病的影响,提供了稳定的大鼠模型。