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每年都有成千上万的婴幼儿在全身麻醉下接受各种有创检查或外科手术。然而,全身麻醉对大脑的神经发育和学习记忆能力的影响究竟如何不仅是患者及家属最关心的问题,更是麻醉学、神经生物学和药理学研究的热点之一。近30年前,美国科学会的胎儿和新生儿委员会发表一项声明,强烈建议在所有新生儿手术中使用麻醉药物。2016年12月14日,美国食品与药物管理局(FDA)发布警示——“3岁以下的儿童或妊娠末三个月的孕妇在手术或手术过程中反复使用全身麻醉和镇静药物可能会影响儿童的大脑发育”。这一声明引起了众多患儿家属的恐慌,而各国麻醉专业协会对于FDA的这一警示仍持保留意见,针对这一问题目前并没有一个准确的答案。异丙酚作为目前临床上应用最广泛的静脉麻醉药,因其起效快,作用时间短等优点被广泛应用于全身麻醉的诱导和维持,区域麻醉镇静,门诊小手术和内镜检查等,因此异丙酚对神经系统的作用如何一直以来更加备受关注。早期较多研究表明异丙酚因其抗炎作用可减少应激与炎症反应进而对缺血性脑损伤产生神经保护作用。然而近年来已有研究认为异丙酚可通过抑制神经营养因子如BDNF、NGF[1];调节GABAA受体[2];microRNA的转录后调节[3]等机制导致神经干细胞凋亡,减少神经元数目,引起突触发育异常,进而影响学习记忆能力与认知功能。因此进一步探索异丙酚在神经发育过程中的作用机制是一个重要科学问题。实验方法1.实验分组及给药将原代培养的大鼠胚胎神经干细胞(NSC)分为5组,对照组(Null)即无任何处理,溶剂对照组(Vehicle)给予等量的DMSO,异丙酚处理分三个浓度组:25 μmol/L 组、50 μmol/L组和 100μmol/L 组。2.细胞活性测定实验将神经干细胞按照上述分组,异丙酚组分别用终浓度为25、50、100μmol/L的异丙酚,空白对照组和溶剂组分别用同体积的DMEM/F12和DMSO(0.5%)处理细胞。作用时间分别对应6、12、24小时,作用时间结束后加入CCK8试剂,检测细胞存活率。3.二代测序及差异表达的microRNA的验证通过细胞活性检测,筛选出异丙酚作用于神经干细胞的最适的时间和浓度,作用结束后,提取细胞的总RNA。建立cDNA文库,二代测序检测异丙酚处理组较之对照组差异表达的microRNAs,并应用实时荧光定量PCR检测差异表达的 microRNAs。4.差异表达的microRNA的靶基因预测本研究应用miRWalk 2.0在线软件的四个数据库(miRWalk,miRanda,miRDB,TargetScan)对验证的差异表达的microRNAs进行靶基因预测。5.GO和KEGG富集分析本研究应用DAVID在线软件中的GO和KEGG数据库,分析了差异表达的miRNAs的靶基因,并且针对靶基因分别作了 GO和KEGG的富集分析。应用cytoccape软件得到靶基因之间的相互作用(PPI)、靶基因与相关通路的相互作用的网状图。6.实时荧光定量PCR和Western Blot应用实时荧光定量PCR检测差异表达的microRNAs和靶基因Gabbr1、Canca1b、Cabbr2 的 mRNA 表达水平,应用 Western Blot 检测 Gabbr1、Canca1b、Cabbr2的蛋白表达情况。7.统计学处理计量资料以均数±标准差(x[]±s)表示,采用SPSS 20.0软件分析,P<0.05即认为差异具有统计学意义。microRNA的差异表达分析用edgeR(Re1ease 3.5)。实验结果1.异丙酚对神经干细胞活性的影响与Control相比,异丙酚50、10Oμmol/L组的细胞存活率明显下降(P<0.05),且呈现浓度依赖性,但是并没有显示时间依赖性。Vehicle组较之Control组无明显差异(P>0.05)。2.异丙酚对神经干细胞内microRNA表达谱的影响异丙酚处理后,将神经干细胞的RNA进行二代测序。与Vehicle组相比,Popofol 组有 27 个差异表达的 microRNAs(|log2(foldchange)|≥1)。qRT-PCR 验证得出异丙酚组miR-377-5p,miR-194-3p和miR-143-5p的表达明显上调,将三者组合为A组,miR-3583-3p,miR-466b-5p和miR-410-5p的表达明显下调,将其命名为B组(P<0.05)。3.靶基因预测分别将两组中差异表达的miRNAs进行靶基因预测。再将每组中各microRNAs的靶基因取交集。A组中三个microRNAs得到365个共同靶基因,B组中得到209个共同靶基因。4.靶基因的GO和KEGG分析应用预测出的靶基因进行GO和KEGG富集分析,发现Gabbr1,Canca1b和Gabbr2高度富集于GABAergic synapse通路中。5.异丙酚调节Gabbr1,Canca1b和Cabbr2的表达与Vehicle组相比,异丙酚组的Gabbr 1,Canca1b的表达明显下调而Gabbr2的表达上调(P<0.05),这一变化趋势符合miRNA调节靶基因的规则。结论本研究应用miR测序技术分析并验证了异丙酚作用后,大鼠胚胎神经干细胞差异表达的6个microRNA。生信分析和后续验证结果表明表达上调的miR-377-5p,miR-194-3p、miR-143-5p 和表达下调的 miR-3583-3p,miR-466b-5p、miR-410-5p 可分别调控 GABAergic 信号通路中的 Gabbr1、Canca1b 和 Gabbr2,提示异丙酚可能通过GABAergic信号通路调控神经干细胞的凋亡,进而影响神经发育,影响学习记忆能力。我们的研究结果可能有助于阐明异丙酚药物神经毒性的分子机制,并有可能提供针对异丙酚产生神经毒性的潜在的治疗靶点。