背景肝细胞癌(hepatocelluar carcinoma,HCC)是最常见的肝脏原发性肿瘤,主要发生在患有肝硬化的慢性肝病患者中,是全球最常见的第六大恶性肿瘤。多项研究发现,肝细胞癌是这类人群致死的最常见原因,其癌症致死率在所有恶性肿瘤中排名第三。肝细胞癌是当前一个重要的医疗问题,具有独特的流行病学特征,是与进展相关的不同风险因素的可变流行率密切相关的疾病,在全球分布非常不均匀。肝细胞癌在亚洲和非洲的发病率最高,而我国的肝细胞癌患病率在全球中排第一,大多数肝癌的病例发生与乙型肝炎病毒密切相关。在发达国家,肝细胞癌的发生与丙型肝炎病毒的感染具有极大的相关性。在过去的几十年间,对于肝癌的研究及治疗虽然取得了极大的进步,但是大多数患者在诊断之时己处于疾病进展期,因此肝细胞癌患者的预后仍然不是非常理想。手术切除治疗是在非肝硬化肝脏上单一肿瘤的首选治疗方式,允许大范围切除,且并发症的风险较低。其他的治疗方式还包括肝脏移植、消融技术、化疗栓塞、系统化疗、肝内放射线及免疫治疗等。目前对于进展期肝癌可供选择的治疗策略有限,设计合理的化疗方案及靶向治疗方法已成为肝癌临床治疗的热点。口服多重激酶抑制剂瑞戈非尼(Regorafenib)可通过抗血管生成潜在地抑制肿瘤生长。几种血管激酶如VEGFR1/2、PDGFR-b和FGFR1被认为是瑞戈非尼治疗肿瘤的的主要靶点。美国FDA在2012年批准瑞戈非尼用于治疗转移性结肠直肠癌和晚期胃肠道间质肿瘤患者。由于瑞戈非尼的化学结构与索拉非尼的化学结构非常相似,小分子靶向治疗药物瑞戈非尼也被通过批准用于HCC的治疗,国外已开始进行多项体外研究和临床试验,以评估瑞戈非尼对HCC的疗效。HCC的患者口服瑞戈非尼的安全剂量为160 mg/日,且2016年Bruitz在《Lancet》报道了针对肝脏功能评估为ChildA级且对索拉非尼耐药或在使用索拉菲尼治疗期间出现癌症进展的肝细胞癌患者的一项3期临床实验证实瑞戈非尼联合索拉菲尼组对比索拉菲尼联合安慰剂组可显著延长2.8个月的总生存期,进一步说明瑞戈菲尼比索拉菲尼具有更有效的潜在的药理活性。信号转导及转录激活因子3(STAT3)是JAK/STAT3信号通路的一个组成部分,参与机体的多种生理和病理生理过程。JAK/STAT3信号通路的活化可以刺激细胞增殖,分化,迁移和凋亡。该信号通路对造血,免疫发育,乳腺发育和哺乳,脂肪形成,性别二态性生长起着致关重要的作用。STAT3主要通过细胞因子和相应受体结合后,引起受体分子的二聚化,这使得与受体偶联的JAK激酶相互接近,并通过交互的酪氨酸磷酸化作用激活,进一步使STAT3发生磷酸化,形成激活的STAT3二聚体,核易位,随后激活各种STAT3靶基因,调节细胞存活、迁移、侵袭、免疫逃避和血管生成。STAT3是细胞质信号分子和核转录因子,其通过JAK激酶对多种细胞因子(包括IL-6、IFN、表皮生长因子和FGF等)的响应是通过其羧基末端的酪氨酸残基磷酸化而被激活。在细胞核中,STAT3调节线粒体介导的细胞凋亡蛋白质的表达,如Bc1-2、Mcl-1和cIAP2等。截止目前瑞戈非尼的作用机制并不明了,在PubMed,中国知网及万方数据库中未检索到相关文献。目的为探讨瑞戈非尼是否可通过JAK/STAT3信号通路影响肝癌细胞发生,发展及侵袭的作用机制,本研究中我们首先检测人肝细胞癌组织中STAT3蛋白,p-STAT3蛋白及STAT3 mRNA的表达,分析它们与肝细胞癌发生及进展的关系,其次应用瑞戈非尼作用于2个原发性肝癌细胞株(LM3、HUH7),观察它通过JAK/STAT3信号通路对肝细胞癌细胞株增殖、凋亡及侵袭的作用及其相关分子机制。并通过研究肝癌细胞株裸鼠皮下移植瘤模型及肺转移瘤模型,进一步探讨瑞戈非尼通过JAK/STAT3信号通路对肝癌细胞增殖、凋亡与侵袭中的作用及机制。本研究共分为以下三部分。主要内容:第一部分:STAT3在肝细胞癌中表达及其意义方法1.采用免疫组织化学方法(Immunohistochemistry,IHC),免疫印迹法(Western blot)及逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测78例人肝癌组织及50例肝癌癌旁组织中p-STAT3蛋白,STAT3蛋白及STAT3 mRNA,表达情况。2.统计学处理:应用SPSS19.0软件处理,采用X2检验、t检验和方差分析,检验水准α=0.05。结果通过免疫组化,Western blot及RT-PCR检测发现:1.免疫组化检测p-STAT3蛋白在肝细胞癌组织中的表达高于癌旁组织,两者间差异有统计学意义(p<0.05)。Western blot检测STAT3癌组织和癌旁组织之间表达量没有显著性差异(p>0.05),p-STAT3癌组织和癌旁组织之间相比,癌组织表达量明显高于癌旁组织,两者之间具有显著性差异(p<0.05)。RT-PCR检测结果表明,STAT3 mRNA的表达在肝细胞癌组织和癌旁组织中没有显著性差异(p>0.05)。2.p-STAT3蛋白及STAT3 mRNA的表达与肝细胞癌患者的年龄与性别差别无关(p>0.05)。3.p-STAT3蛋白及STAT3 mRNA的表达量随着肝细胞癌细胞组织学分化程度的降低依次升高,差异有统计学意义(p<0.05)。4.p-STAT3蛋白及STAT3 mRNA的表达量在肝细胞癌淋巴结转移患者中高于未转移的患者,差异有统计学意义(p<0.05)。5.p-STAT3蛋白及STAT3 mRNA的表达量随着肝细胞癌患者TNM分期的增高而依次升高,差异有统计学意义(p<0.05)。第二部分:瑞戈非尼对肝癌细胞的细胞生物学特征的影响及机制研究方法1.通过Weteern blot实验来验证在4种HepG2、Hep3B、LM3、HUH7肝癌细胞株中JAK1、JAK2、STAT3、p-STAT3、MMP2和MMP9的表达情况。选择具有较高蛋白表达的两肿肝癌细胞株:LM3和HUH7做进一步研究。2.将2种肝癌细胞株(LM3和HUH7)种植到96孔板中,通过MTT实验,设置 0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L的瑞戈非尼浓度梯度来观察不同药物浓度对肝癌细胞系的抑制情况,找到药物IC50,采用该浓度进行后续的实验。设置Oh、24h、48h、72h、96h五个时间梯度,观察瑞戈非尼用药前后对肝癌细胞细胞株的抑制情况。3.通过克隆形成试验和EdU增殖试验检测瑞戈非尼用药前后对2种肝癌细胞株增殖的抑制作用。4.通过流式细胞检测瑞戈非尼对肝癌细胞的周期和凋亡的影响,通过caspase3和caspase9凋亡试剂盒检测肝癌细胞的凋亡情况。5.通过Transwell实验,检测瑞戈非尼用药前后对两种肝癌细胞株侵袭和迁移能力的抑制作用。6.通过RT-PCR检测瑞戈非尼用药前后对2种肝癌细胞株JAK1、JAK2和STAT3 mRNA的表达情况。7.通过Western blot检测检测肝癌细胞株LM3及LM3-STAT3中瑞戈非尼用药前后 JAK1、p-JAK1、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、casepase3、cleaved-caspase3、caspase9、cleaved-caspase9、MMP2、MMP9 蛋白的表达。结果1.在4株肝细胞癌细胞株中,LM3和HUH7肝癌细胞株JAK1、JAK2、STAT3、p-STAT3、MMP2和MMP9的蛋白表达相对比较丰富。随后选择LM3和HUH7肝癌细胞株进行相关研究。2.两株细胞(LM3和HUH7)经过不同浓度的瑞戈非尼:Oμmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L 和 50μmol/L 处理后发现,随着药物浓度的提高,瑞戈非尼对肝癌细胞株LM3和HUH7的生长抑制逐渐增强,呈剂量依赖关系,HUH7细胞株的IC50的浓度为9.887μmol/L(R2=0.9328),LM3的IC50的浓度为9.914μmol/L(R2=0.9096),选择l0μmol/L作为药物处理浓度进行后续研究。1Oμmol/L瑞戈非尼处理LM3和HUH7细胞,检测不同时间瑞戈非尼对细胞的抑制作用,结果表明在48h药物抑制作用最为明显。3.通过克隆形成试验及EdU增殖实验发现:与对照组(未加药)相比,实验组(瑞戈非尼10μmol/L)肝癌细胞的增殖被明显抑制,在两种细胞系中组间差异均有统计学意义(p<0.05)。4.流式细胞学检测发现:与对照组(未加药)相比,实验组(瑞戈非尼10μmol/L)肝癌细胞发生G2/M期的周期阻滞,在两种细胞系中组间差异均有统计学意义(p<0.05)。5.通过流式细胞学检测发现:与对照组(未加药)相比,实验组(瑞戈非尼l0μmol/L)肝癌细胞的凋亡明显的增强,在两种细胞系中组间差异均有统计学意义(p<0.05)。6.通过caspase3和caspase9凋亡试剂盒检测发现:与对照组(未加药)相比,实验组(瑞戈非尼1Oμmiol/L)肝癌细胞caspase3和caspase9活性增强,在两种细胞系中组间差异均有统计学意义(p<0.05)。7.通过Transwell实验检测发现瑞戈非尼可以抑制肝癌细胞的迁移能力和侵袭能力,对照组(未加药)与实验组(瑞戈非尼10μmol/L)相比差别有统计学意义(p<0.05)。8.通过RT-PCR检测在2种肝癌细胞株中对照组(未加药)与实验组(瑞戈非尼10μmol/L)JAK1、JAK2和STAT3 mRNA的表达情况没有差异性(p>0.05)。9.在肝癌细胞系LM3中,实验组细胞中STAT3、JAK1及JAK2蛋白的表达量与对照组相比均无差异(p>0.05),p-STAT3、p-JAK1、p-JAK2、caspase3、caspase9、MMP2和MMP9蛋白的表达量与对照组相比均明显减少(p<0.05),而cleaved-caspase3和cleaved-caspase9的表达量明显升高(p<0.01)。在肝癌细胞系LM3-STAT3中,实验组细胞中p-JAK1及p-JAK2蛋白的表达量与对照组相比均明显减少(p<0.05),STAT3、p-STAT3、JAK1、JAK2、caspase3、cleaved-caspase3、caspase9、cleaved-caspase9、MMP2 和 MMP9 蛋白的表达量与对照组相比均无差异(p>0.05)。第三部分:瑞戈非尼在裸鼠肿瘤模型中的作用及机制研究方法1.选取肝癌细胞株LM3及LM3-STAT3构建裸鼠皮下移植瘤模型。2.比较裸鼠皮下移植瘤模型中实验组(瑞戈非尼)与对照组(生理盐水)肿瘤大小的差异;3.选取肝癌细胞株LM3及LM3-STAT3构建裸鼠肺转移瘤模型。4.比较裸鼠肺转移瘤模型中实验组(瑞戈非尼)与对照组(生理盐水)肿瘤数量的的差异;5.通过免疫组织化学分析,裸鼠肿瘤模型中实验组(瑞戈非尼)与对照组(生理盐水)p-STAT3的表达情况。6.经Western-Blot方法分析,裸鼠肿瘤模型中实验组(瑞戈非尼)与对照组(生理盐水)JAK1、p-JAK1、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、MMP9 和MMP2的表达情况。结果1.与对照组相比,瑞戈非尼能够明显的抑制LM3皮下移植瘤模型组裸鼠肿瘤的大小,差异有显著性(p<0.05),瑞戈非尼处理组肺转移数目明显低于对照组(p<0.05);LM3-STAT3模型组,STAT3过表达后可以明显抑制瑞戈非尼的作用。2.通过免疫组织化学检测,在LM3皮下移植瘤模型中,与对照组相比,瑞戈非尼处理后的裸鼠肿瘤p-STAT3的表达降低,差异有显著性(p<0.05)。在LM3-STAT3肿瘤模型中,与对照组相比,瑞戈非尼处理后的裸鼠肿瘤p-STAT3的表达量无差异(p>0.05)3.通过Western blot检测发现,在LM3肿瘤模型中,与对照组相比,瑞戈非尼处理后的裸鼠移植瘤组织中中JAK1、JAK2和STAT3表达量无差异(p>0.05),而 p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3、MMP2 和 MMP9 蛋白的表达均降低,差异有显著性(p<0.05)。在LM3-STAT3皮下移植瘤模型中,与对照组相比,瑞戈非尼处理后的裸鼠肿瘤中JAK1、JAK2、STAT3、p-STAT3、MMP2和MMP9表达量无差异(p>0.05),而p-JAK1和p-JAK2和蛋白的表达均降低,差异具有显著性(p<0.05)。结论1.肝细胞癌组织中p-STAT3蛋白和STAT3 mRNA的高表达与肝细胞癌的发生,发展,浸润及转移具有相关性。2.瑞戈非尼可以抑制肝癌细胞株的增殖,迁移,侵袭,并促进凋亡。3.体内外实验表明瑞戈非尼可以通过抑制JAK/STAT3信号通路中p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3等蛋白磷酸化,调控caspase3和caspase9的活化,以及抑制MMP2和MMP9蛋白表达,进而抑制肝癌细胞增殖,迁移,侵袭并促进细胞凋亡。