卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vg)是卵黄蛋白(Yolk protein)的前体,它特异存在于卵生雌性动物中。脊椎动物肝脏在雌激素的刺激下产生Vg,随后Vg被分泌到血液中并随血液循环系统进入卵巢,被卵巢吸收后分解成卵黄脂磷蛋白(lipovitellin)和卵黄高磷蛋白(phosvitin),为胚胎和幼体生长发育提供能量与营养物质。Vg通常情况下只存在于雌性动物中,但是在17β-雌二醇(17-β-estradiol,E2)的诱导下,雄性成体以及未性成熟的幼体也可以表达Vg。另一方面,在抗雌激素如它莫西芬(Tamoxifen, TMX)的诱导下,雌性动物的Vg表达会被抑制。目前,越来越多的研究表明,Vg除了可以为胚胎发育提供营养以外,还具有其它生物学功能。其中,免疫防御是比较受关注的一项功能。体外实验已经证明Vg具有识别病原相关分子模式的功能,并且具有凝血活性和抑菌活性。然而关于Vg在体内是否具有免疫防御的作用,目前还知之甚少。因此,本文从以下几个方面探讨了Vg在体内的免疫防御作用:一、研究病原相关模式分子是否能够诱导雄性斑马鱼表达Vg以及所表达的Vg是否具有抑菌活性;二、研究当斑马鱼受到病原菌侵害时,Vg是否能够对斑马鱼起到一定的保护作用。论文第一部分的研究表明,Vg是一种急性时相蛋白。在脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)和脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)的诱导下,雄性斑马鱼能够迅速表达Vg,表达模式类似于急性时相蛋白;并且诱导表达的Vg能够与细菌结合并具有抑菌活性。本文用腹腔注射法向雄性斑马鱼注射LPS和LTA,然后在注射后0h、0.5h、1h、2h、3h、5h、9h和12h分别提取斑马鱼总RNA和血清。通过荧光实时定量PCR(Real-time PCR)和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测雄性斑马鱼Vg在mRNA和蛋白水平的表达情况。实验结果表明:注射LPS后,Vg1基因立即开始大量表达,在0.5h达到正常雄鱼的104.1倍,在2h达到峰值,为正常雄鱼Vg1基因表达量的193.2倍,并在此后所检测的12小时内维持在较高的表达水平。在注射LTA0.5h以后,雄鱼Vg1基因表达量达到正常雄鱼的45倍,此后的表达水平与对照组相当。对照组注射生理盐水后,Vg1基因表达量变化不大。在蛋白水平,Vg的表达量也有显著上升,注射LPS0.5小时后,血清Vg表达量即开始显著上升,为对照组的1.3倍;注射LTA 5h后,Vg表达量开始显著上升,9h时血清中的Vg为对照组的1.2倍。由此可以看出,病原相关分子模式LPS和LTA能够有效诱导斑马鱼Vg表达。因此,斑马鱼Vg的表达模式具有急性时相反应的特点,是一种急性时相蛋白。本文应用Western blotting检测了Vg是否能够与细菌结合。将LPS诱导0.5h的雄鱼血清分别与大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)共同孵育,然后洗脱细菌上结合的蛋白,用洗脱下的蛋白进行western blotting,抗体为兔抗斑马鱼Vg多克隆抗体。结果表明,Vg与大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)都能结合。本文用LPS诱导0.5h的雄性斑马鱼血清(Vg含量高)进行抑菌实验,结果表明:它对大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)抑菌能力分别比对照组高6.8%和6.6%;经过加热灭活补体后,对两种菌的抑菌能力比对照组分别高18.3%和11.4%;经过加热灭活补体,然后又加入不同量的Vg抗体以沉淀血清中的Vg,随着Vg抗体量的加大,血清的抑菌活性逐渐降低,在加入过量Vg抗体后,其抑菌活性与对照组无显著差异,与加入抗体之前的血清相比,对两种菌的抑菌活性分别降低18.6%和11.7%。由此可见,Vg的抑菌活性是显著的,而且其对革兰氏阴性菌的抑制率高于对革兰氏阳性菌的抑制率。论文第二部分首先探索了E2和TMX合适的诱导浓度及诱导时间,目的是既能显著调控Vg表达量又不对斑马鱼造成损伤。结果表明:20 nM E2诱导斑马鱼20天后,Vg表达量显著上升,其肝实质细胞形态仍然保持正常,肝脏基本未受影响;500 nM TMX诱导斑马鱼20天后,Vg表达量显著下降,肝实质细胞形态也基本保持正常,肝脏功能未受影响。然后我们又研究了E2和TMX对斑马鱼免疫球蛋白IgM(Immunoglobulin M)和白细胞密度的影响,结果表明:E2和TMX都能够提高斑马鱼血清中IgM的水平,但是两者对IgM的诱导作用差别不大;E2和TMX对白细胞密度都无显著影响。最后我们用鳗弧菌V. auguillarum对20 nM E2和500 nM TMX诱导20天的斑马鱼以及正常斑马鱼进行攻毒,实验结果表明:E2诱导的雌鱼的存活率显著高于正常雌鱼和TMX诱导的雌鱼;E2诱导的雄鱼的存活率与正常雄鱼相仿,但是显著高于TMX诱导的雄鱼。说明当斑马鱼受到病原菌入侵时,Vg对斑马鱼可能具有一定的保护作用,能够提高斑马鱼的存活率。然而关于Vg的作用机制,还有待于进一步研究。综上所述,本文发现斑马鱼Vg是一种急性时相蛋白,病原相关分子模式LPS和LTA能够诱导雄性斑马鱼表达Vg,其表达模式具有急性时相反应的特点;而且所表达的Vg具有抑菌作用。另外,实验表明,当斑马鱼受到病原菌入侵时,Vg对提高斑马鱼存活率可能具有一定作用。