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盲目通常是视网膜的光感受器细胞退化、死亡所致的变性疾病,比如视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)和年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration)。因为个体出生后光感受器就停止分裂了,故人们一直认为他们不能被替代。近些年来,人们为了挽救终末阶段的视网膜病变,尝试了移植干细胞、视网膜、视网膜组织片和视网膜神经元等多种方法,其中干细胞移植治疗RP是目前极具潜在临床应用价值的方法。
MacLaren不仅成功地使移植的小鼠视网膜祖细胞发育为成熟光感受器,还提高了瞳孔对光反射,提示人胚胎组织和人胚胎干细胞可能是视网膜退行性病变细胞移植的良好细胞来源。目前用于视网膜移植的细胞和组织主要有胚胎干细胞、造血干细胞、神经干细胞、胎期和成体的视网膜干细胞、胚胎神经视网膜层、胚胎全层视网膜(神经视网膜和RPE)层,但人胚胎组织和人胚胎干细胞的使用始终存在伦理学限制而来源不足,并且异体移植或多或少会存在免疫排斥问题。为了克服这些缺点,骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)就成为了人们的理想目标。BMSCs可以通过自体取材获得,且具有分离培养较为容易,排斥反应较弱,无致瘤性等特点,已成为一种极有潜力的成体干细胞。
细胞移植退行性病变的视网膜后虽然能改善瞳孔对光反射,但是其它的指标诸如方向感和追踪物体能力并未提高,所以Maclaren的成果是否可应用于临床引起了人们的思索。Bennett认为这是由于Maclaren仅观察到0.03-0.1％的移植细胞能整合入宿主视网膜并建立突触联系,那么对供体祖细胞进行处理或诱导胚胎干细胞表达特定的促分化和整合的基因可能可以提高整合的效率从而进一步改善视功能。Lamba以“鸡尾酒诱导法”将人胚胎干细胞H1株成功地诱导为视网膜祖细胞,其基因表达与人胎儿视网膜的祖细胞类似,诱导成功率达80％,且诱导出的祖细胞与变性的鼠视网膜共培养可与之整合,其鸡尾酒配方中很重要的一种物质为“可拮抗BMP通路的Noggin”。Noggin基因最早是由California大学的Harland和William于1992年从非洲爪蟾的胚胎中分离得到的。Noggin是非洲蟾蜍胚胎中Spemann organizer分泌的32 kDa的糖蛋白,它对于胚胎发育过程中背侧发育很重要,可以通过拮抗骨形态蛋白2/4来参与神经发生。研究显示,要产生神经诱导需要很高浓度的noggin,提示noggin可能模拟着一种在低浓度下起作用的神经诱导剂(如活化素,可在1×10-12mol/L范围内诱导中胚层)。
基于上述的研究现状,本研究将已经构建重组腺病毒pAdEasy-1-noggin转染人BMSC(hMSCs),观察此方法对转染后细胞向视网膜神经细胞方向分化的影响。并通过荧光定量PCR方法检测视网膜边缘生发区BMP/Noggin信号途径中关键分子noggin、BMP、Pten和β-catenin的表达,分析其表达水平在RCS大鼠发育过程中的变化,推测noggin基因在大鼠视网膜变性中的作用。在此基础上,将noggin转染hMSCs和未转染hMSCs分别移植至RCS大鼠的视网膜下腔,观察并对比两种策略所移植的细胞在变性视网膜内的存活、迁移和分化,及其改善视功能重建情况。本研究分为三个部分:
第一部分:携带小鼠noggin基因的重组腺病毒载体对人骨髓间充质干细胞的定向诱导作用
以pAdEasy-1-noggin转染原代培养的hMSCs并观察其形态学变化、鉴定其是否向神经细胞方向分化。
原代培养细胞生长良好,10天左右融合成单层,传代后细胞呈均一的成纤维细胞样。成功利用noggin腺病毒载体体外转染hMSCs,noggin转染后hMSCs可以自发绿色荧光,其性状稳定,在转染10天时不仅具有神经细胞的形态学特征,而且表达多种神经细胞特异性标记物(opsin阳性,18.4±1.5％;NF200阳性,20.3±1.7％;chx10阳性,4.8±0.6％;nestin阳性,4.2±0.8％;Nrl阳性,3.7±0.4％)。
第二部分:RCS大鼠视网膜发育过程中Noggin的变化
以荧光定量PCR方法检测PN15d、PN30d、PN60d RCS大鼠视网膜边缘生发区BMP/Noggin信号途径中关键分子noggin、BMP、Pten和β-catenin的表达,结果显示:
1.4个关键分子noggin、BMP4、Pten、β-catenin在RCS大鼠和Long-Evans大鼠视网膜缘和睫状体平坦部均有表达。
2.RCS大鼠在发育过程中,随着大量感光细胞的死亡,PN30d时,BMP4表达显著下调,在PN60d,noggin基因表达出现显著上调,β-catenin表达有非常显著性降低,Pten基因无显著变化趋势。
第三部分:RCS大鼠视网膜下腔移植Noggin基因转染人骨髓间充质干细胞的研究
将DiI荧光标记的未转染hMSCs和noggin转染hMSCs移植入30天龄:RCS大鼠的视网膜下腔,以Long-Evans大鼠作为正常对照,观察移植后不同时间点,移植细胞在宿主视网膜下腔存活、迁移和分化情况,以及对视功能的改善。结果显示:
1.不论是经DiI染色的未转染细胞还是自发绿色荧光的腺病毒载体转染细胞,在两种大鼠视网膜内都可以存活,noggin转染hMSCs存活数量多于未转染hMSCs。
2.移植细胞可以发生迁移,移植至RCS大鼠后不同时间点,noggin转染hMSCs迁移距离皆显著高于未转染hMSCs;而移植至Long-Evans大鼠时,在移植后2周,noggin转染hMSCs迁移距离稍高于hMSCs-对照组,在移植后1月和2月,noggin转染hMSCs迁移距离均显著高于未转染hMSCs。
3.未转染hMSCs移植至RCS大鼠后仅在2个月时,可见少量成熟神经细胞标记物NF200阳性的移植细胞,未转染hMSCs移植至Long-Evans大鼠时亦仅在2个月出现少量opsin可疑阳性的移植细胞;noggin转染hMSCs在移植RCS大鼠后2周,即可见nestin,chx10阳性的移植细胞,在移植后2个月,可见NF200、nestin、chx10、opsin阳性的移植细胞
4.noggin转染hMSCs移植RCS大鼠后2个月,Rod-ERG和Max-ERG波形都有明显改善,b波仍存在而非熄灭型,且b波的潜时缩短、幅值增高。
结论:
1.成功利用pAdTrack-CMV/Noggin腺病毒载体体外转染hMSCs,运用50的病毒滴度转染后发现约70％的细胞呈GFP阳性且细胞无病理反应;
2.noggin转染hMSCs性状稳定,转染后4天已长出神经细胞样突起,转染后10天已具有复杂的神经细胞样突起,且可表达视网膜干细胞、光感受器细胞的特异性标记物,与经典的化学诱导剂EGF相比,noggin可以显著提高hMSCs向视网膜干细胞和光感受器细胞的分化率;
3.noggin、BMP4、Pten、β-catenin在RCS大鼠和Long-Evans大鼠视网膜缘和睫状体平坦部均有表达,说明了RCS大鼠变性过程中视网膜干细胞出现激活,从而发挥机体的修复机制;
4.RCS大鼠视网膜变性过程中,视网膜缘和睫状体平坦部BMP4/noggin信号途径出现激活,下游分子β-catenin表达显著下调,说明RCS大鼠变性过程中noggin对视网膜干细胞发挥了重要调控作用;
5.未转染hMSCs或者noggin转染hMSCs移植入30天龄的RCS大鼠视网膜下腔后,与同龄Long-Evans大鼠相比,其在RCS大鼠视网膜内存活更多,有更强的迁移能力,不仅如此,还可以分化为更多类型和更高比例的神经细胞,这说明RCS大鼠早期变性视网膜的微环境有利于移植细胞的存活,迁移和分化;
6.noggin转染hMSCs移植至RCS大鼠视网膜后无免疫排斥反应,可以较好存活,具备显著的迁移能力,并可分化为视网膜干细胞、光感受器细胞等,且可显著改善RCS大鼠Rod-ERG和Max-ERG,表明noggin诱导hMSCs移植入RCS大鼠的视网膜下腔能在体分化为光感受器细胞、并进一步增强noggin的表达而延缓视网膜色素变性的发展。