研究背景：　　 自1957年以来,手足口病在世界多个国家爆发流行,特别是20世纪90年代以来,在亚太地区流行日益猖獗。2007年以来在中国大陆发生手足口病爆发流行,至2010年9月底,累计报告300多万感染病例,严重威胁儿童的身体健康和生命安全。手足口病的病原体主要是小RNA病毒科,肠道病毒属成员,柯萨奇A组16型(Coxsakie A16,CoxA16)和肠道病毒71型(enterovirus71,EV71)最为常见,其中EV71病毒是导致神经系统并发症和死亡病例的主要病原体。依据VP1基因核苷酸序列的差异,国内外学者将EV71分为A、B、C3个基因型,在中国大陆主要是C型。但对中国大陆EV71的长期进化情况还知之甚少；特别是病毒基因进化和变异与2007年以来中国大陆手足口病疫情之间的关系也没有得到阐明。因此,本课题收集了1987年到2009年中国大陆EV71代表毒株,分析中国大陆EV71病毒的进化及其与2007年以来手足口疫情之间的关系。　　 目前还没有有效的疫苗用以EV71的预防,但脊髓灰质炎疫苗在控制全球脊髓灰质炎病毒传播中的成功实践,给EV71疫苗的研制带来了希望,疫苗的研究是EV71研究领域的一个热点。目前不同形式的EV71疫苗都处于研发阶段,病毒样颗粒(Virus Like Particle,VLP)疫苗是一种新型的疫苗,是通过分子生物学技术,表达病毒的一个或多个结构蛋白,这些结构蛋白具有天然的自装配能力,可形成与真正病毒颗粒相同或相似的空心颗粒,没有病毒的核酸,不能自主复制,没有感染性,表面有高密度的病毒抗原,保存了构象表位,可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞,有效诱导机体免疫系统产生免疫保护反应。本课题在对现有EV71疫苗进行比较研究的基础上,创新性地选择毕赤酵母表达系统制备EV71病毒样颗粒,并对其免疫原性进行了研究。　　 研究方法：　　 1.EV71病毒VP1基因分子进化分析:对2008年广东省9株EV71病毒的VP1基因进行测序,根据分离时间和地点从Genbank中筛选了64株参考毒株,包括1987—2009年间从中国大陆和台湾分离的毒株39株,法国7株,荷兰7株,马来西亚3株,澳大利亚3株,新加坡2株,美国2株,韩国1株。甩BioEdit软件对73株毒株的VP1基因相似性得分进行了计算,用Mega4.0软件的neighbor-joining方法对73株毒株的VP1基因进行了进化分析。　　 2.EV71病毒样颗粒构建:选择属于C6基因亚型的广东省2008年第一例死亡病例毒株(Foshan2008-FJ194964)制备病毒样颗粒,提取Foshan2008-FJ194964株病毒RNA,RT-PCR扩增P1和3CD基因,分别构建EV71 P1基因和pGAPZαA重组质粒(P1-pGAPZαA)及3CD基因和pGAPZαA重组质粒(3CD-pGAPZαA)；将3CD—pGAPZαA重组质粒电转化到SMD1168酵母细胞,构建3CD-pGAPZαA-SMD1168重组菌株；将P1-pGAPZαA电转化至3CD-pGAPZαA—SMD1168重组菌株,构建P1—pGAPZαA-3CD—pGAPZαA-SMD1168重组菌株；表达P1和3CD蛋白,及EV71病毒样颗粒；用Tricine-SDS-PAGE和Western-blot鉴定P1-pGAPZαA-3CD-pGAPZαA-SMD1168重组菌株蛋白表达；电镜观察EV71病毒样颗粒,并用Tricine—SDS-PAGE和Western-blot鉴定纯化的病毒样颗粒。　　 3.EV71病毒样颗粒免疫原性研究:用制备的EV71病毒样颗粒免疫小鼠,测定血清中特异性IgG抗体的产生水平,体外中和试验测定免疫小鼠的中和抗体效价评价体液免疫情况；用VLP刺激小鼠脾细胞进行淋巴细胞增殖试验测定T细胞增殖情况,并测定受VLP刺激的脾细胞细胞因子分泌水平,了解所制备EV71VLP诱导细胞免疫的效果。　　 研究结果：　　 1.EV71病毒VP1基因分子进化:通过VP1基因进化树分析和同源性比较,发现1987年到2009年间,先后共有C2,C3,C4,C6基因亚型和A基因型EV71病毒在中国大陆流行。在20世纪80年代,中国大陆主要是C2基因亚型流行,接着是C3基因亚型,1998年开始出现C4基因亚型流行,并成为优势毒株；从2002年开始,在中国大陆出现了一种新的C6基因亚型,取代C4基因亚型成为中国大陆EV71的优势毒株。一直以来从加利福尼亚分离的CaliforniaBrCr1970-AF135885毒株是唯一的一株A基因型毒株,但2008年和2009年在安徽和湖北省分离到了A基因型毒株。VP1基因184位苏氨酸在B基因型保守；167位和282位的门冬氨酸在A基因型保守,240位苏氨酸和249位缬氨酸在C基因型保守。　　 2.EV71病毒样颗粒的制备:扩增了P1基因,3CD基因,并分别与pGAPZαA连接,成功构建了P1-pGAPZαA和3CD-pGAPZαA重组质粒,测序鉴定重组质粒构建成功；用电穿孔仪先将3CD-pGAPZαA转入SMD1168表达菌株,得到3CD—pGAPZαA-SMD1168重组表达菌株,然后再将P1-pGAPZαA转入3CD-pGAPZαA-SMD1168重组表达菌株,得到P1-pGAPZαA-3CD—pGAPZαA—SMD1168重组表达菌株,制备了EV71病毒样颗粒。用Tricine—SDS—PAGE和Western—blot鉴定表明表达的P1蛋白成功被3CD蛋白酶切成大小分别为39KDa,36KDa和129KDa的VP0,VP1和VP3蛋白。电镜下观察看到整齐、均一的、直径约20nm的病毒样颗粒。　　 3.EV71病毒样颗粒免疫原性评价:动物实验结果表明用VLP免疫的小鼠能产生特异性IgG抗体和中和抗体,第8周滴度达到最高,分别为211和27,16周时仍能保持较高的抗体滴度。脾细胞在VLP的刺激下发生了明显增殖,并产生了高水平的IL-2,IL-4和IFN-γ,表明诱导产生了Th1细胞免疫反应和Th2细胞免疫反应。　　 研究结论：　　 1.1987年到2009年间,先后共有C2,C3,C4,C6基因亚型和A基因型EV71病毒在中国大陆流行,2002年以来在中国大陆出现了一种新的EV71 C6基因型,是2007以来中国大陆的优势毒株,2008年到2009年间在中国大陆重现EV71病毒A基因型的流行。　　 2.成功构建了P1—pGAPZαA和3CD-pGAPZαA重组质粒,两个重组质粒成功转化入同一酵母菌株,形成P1—pGAPZαA-3CD-pGAPZαA-SMD1168重组菌株,表达了3CD蛋白和P1蛋白,3CD蛋白将P1蛋白酶切为VP0,VP1和VP3蛋白,VP0,VP1和VP3蛋白成功组装成EV71病毒样颗粒。　　 3.EV71病毒样颗粒能够激发小鼠产生特异性IgG和中和抗体,也能激发产生T细胞增殖,诱发Th1和Th2细胞免疫反应,为VLP疫苗研究奠定了坚实基础。