第一部分 产前LPS诱导的大鼠BPD模型的建立以及hUCMSCs对该BPD模型的治疗作用目的:建立产前LPS诱导的新生大鼠BPD模型;观察hUCMSCs对该BPD模型的治疗作用。方法:在SD孕鼠孕20.5天（E20.5）时,通过异弗烷气体（2%）吸入麻醉孕鼠,经孕囊注射LPS（10ug/50ul NS）。然后在E22.5时,行剖宫产手术,剖出注射了 LPS的孕囊内的胎鼠,并交与foster母鼠喂养。随后在新生大鼠PN1、PN7、PN14收集左肺,行HE染色后镜下观察新生鼠肺泡结构,并计算平均肺泡截距（MLI）和次级隔数目以量化肺泡发育情况。在新生鼠PN7时,经气管插管给予将第6代hUCMSCs（1×10^6个/40 μl NS）,对照组给予NS,然后在PN14检测肺功能,并收集左肺标本。通过比较各组新生鼠肺组织发育水平（MLI和RAC）、体重增长情况、微血管数量、肺功能（LR和Cdyn）和右心室肥厚指数,评估hUCMSCs对产前LPS诱导的大鼠BPD模型的治疗作用。结果:1.相比NS对照组（NS+NS组）,LPS组新生鼠肺组织MLI在PN7和PN14显著升高,RAC在PN1、PN7和PN14均明显下降,表现为肺泡内径增大,肺泡简化,次级隔减少;2.相比LPS造模组（LPS+NS组）,干预组经hUCMSCs干预后MLI和RAC都恢复至正常水平;3.LPS造模组出生后体重较NS对照组增长缓慢,hUCMSCs干预后体重有所追赶;4.LPS造模组微血管较NS对照组减少,hUCMSCs干预恢复了微血管数量;5.相比NS对照组,LPS造模组LR显著升高,Cdyn显著下降,hUCMSCs干预逆转了 LR的升高和Cdyn的下降;6.LPS造模组的右心室肥厚指数较正常组明显升高,hUCMSCs干预后右心室肥厚指数下降。结论:1.在母鼠孕期通过孕囊注射LPS可以成功诱导新生鼠肺部出现BPD病理改变;2.hUCMSCs可以改善产前LPS导致的新生鼠肺泡简化,并促进新生鼠生后的体重追赶,恢复微血管数量,改善肺功能损伤,减轻肺动脉高压。第二部分 MVs的提取与鉴定以及MVs治疗产前LPS诱导的大鼠BPD模型的有效性研究目的:提取并鉴定hUCMSCs来源的MVs;观察MVs对产前LPS诱导的大鼠BPD模型的治疗效果。方法:体外培养hUCMSCs,约长满60-70%时,更换为无外泌体培养基培养,48h后收集细胞上清,使用超速离心法提取MVs,通过透射电镜（TEM）检测MVs的形态和大小,粒径跟踪分析仪（NTA）检测MVs粒径大小分布范围,Western blot检测MVs表面标志物CD9,CD63,CD81,TSG101和Alix。将新生鼠分为四组:（1）正常对照组（NS+NS）:E20.5孕囊内注射NS,PN7气管给予NS;（2）正常干预组（NS+MVs）:E20.5孕囊内注射NS,PN7气管给予MVs;（3）LPS造模组（LPS+NS）:E20.5孕囊内注射LPS,PN7气管给予NS;（4）MVs干预组（LPS+MVs）:E20.5孕囊内注射LPS,PN7气管给予MVs。首先在LPS造模组新生大鼠PN7时进行剂量依赖实验（0 μg/只、10 μg/只、20 μg/只、40 μg/只、80 μg/只）,PN14收集标本,观察各剂量组新生鼠肺组织MLI水平,评估MVs有效治疗剂量。然后体外DiO标记MVs,在LPS造模组新生大鼠PN7时通过气管给予DiO标记的MVs,分别在注射后0h、12h、48h、72h、96h收集肺标本,通过免疫荧光染色示踪MVs在新生鼠肺内的持续时间。最后,在PN14收集四组新生鼠肺组织,比较各组新生鼠肺组织发育水平（MLI和RAC）、体重增长情况、微血管数量、肺功能（LR和Cdyn）和右心室肥厚指数,观察MVs对产前LPS诱导的大鼠BPD模型的治疗作用。结果:1.MVs在TEM 下呈圆形囊状结构,直径在500nm左右;粒径分析显示MVs直径多集中在150-900nm,峰值为255nm;MVs阳性表达细胞外囊泡表面标志物CD9、CD63和CD81,不表达TSG101和Alix;2.MVs体内剂量依赖实验提示,在MVs达到20 μg/只水平时,即可降低MLI,并且随着MVs后续剂量的增加,MLI没有进一步改善;3.免疫荧光示踪显示,MVs通过气管进入到肺部后,在前48h逐渐积聚,于48h到达顶峰,随后逐渐下降,并在96小时后完全消失;4.相比正常对照组,LPS造模组新生鼠肺组织在PN14时MLI显著升高,RAC明显下降,MVs干预组MLI和RAC都恢复至正常水平;5.LPS造模组出生后体重较正常对照组增长缓慢,MVs干预后体重追赶至正常水平;6.LPS造模组微血管较正常对照组显著减少,MVs干预未能促进微血管数量的恢复;7.相比正常对照组,LPS造模组LR显著升高,Cdyn显著下降,MVs干预逆转了 LR的升高和Cdyn的下降;8.LPS造模组的右心室肥厚指数较正常对照组明显升高,MVs干预后右心室肥厚指数下降。结论:1.超速离心法可以成功提取出MVs;2.MVs在20 μg/只剂量即可达到治疗水平;3.MVs经气管注射后,48h在肺内达摄取高峰,随后逐渐下降直至96h后完全消失;4.MVs可以改善产前LPS导致的新生鼠肺泡简化,并促进新生鼠的体重追赶,改善肺功能损害,减轻肺动脉高压,但对微血管数量没有明显改善。第三部分 MVs治疗产前LPS诱导的大鼠BPD模型有效性的机制探讨目的:观察MVs治疗产前LPS诱导的大鼠BPD模型的主要靶细胞,探讨MVs治疗BPD的机制。方法:DiO体外预先标记MVs,经气管注射48h后,收集肺组织进行冰冻切片,通过组织免疫荧光染色对MVs与AT1细胞、AT2细胞、内皮细胞、巨噬细胞、间质细胞、周细胞进行共定位,观察MVs在各类细胞中的分布。对各组新生大鼠PN14的肺组织进行冰冻切片,通过SP-C免疫荧光染色观察各组肺组织中AT2数量的差异,Iba-1免疫荧光染色观察各组肺组织中巨噬细胞浸润的程度。ELISA法检测各组肺组织内IL-6和IL-10的水平。利用MLE-12细胞系进行体外实验,分为四组:（1）正常对照组（PBS+PBS）;（2）正常干预组（PBS+MVs）;（3）LPS 组（LPS+PBS）;（4）MVs干预组（LPS+MVs）。通过 Ki67细胞免疫荧光染色和CCK-8实验检测各组MLE-12细胞的增殖和生长情况,Annexin V流式分析检测各组MLE-12细胞的凋亡情况。通过Western blot检测不同组肺组织匀浆中表面活性物质（SP-A1、SP-B、SP-C、SP-D）的表达水平。对LPS造模组和MVs干预组单细胞测序结果进行KEGG通路富集分析,寻找MVs影响显著的细胞亚群和通路。利用WB检测肺组织匀浆中MAPK通路蛋白、PT EN/AKT的表达水平。结果:1.免疫荧光共定位染色显示,MVs有1 8.2%被SP-C（+）细胞摄取,4.5%被AQP-1（+）细胞摄取,7.6%被CD31（+）细胞摄取,14.0%被Iba-1（+）细胞摄取,各有2.4%被α-SMA（+）细胞和NG-2（+）细胞摄取;2.与正常对照组相比,LPS造模组AT2数量显著减少,巨噬细胞浸润显著增多。经MVs干预后,AT2数量明显增多,巨噬细胞浸润明显减少;3.LPS造模组相比正常对照组,IL-6升高,IL-10下降,MVs干预逆转了 IL-6的升高和IL-10的下降;4.体外实验显示,LPS会导致Ki67（+）的MLE-12细胞减少,MVs干预使Ki67（+）的MLE-12细胞显著增多;CCK8显示LPS组MLE-12细胞生长水平较正常组下降,MVs干预组MLE-12细胞生长水平恢复;5.LPS造模组肺表面活性物质SP-A1、SP-B、SP-C和SP-D相比正常对照组均出现下降,MVs干预后SP-C表达恢复;6.单细胞测序结果显示,AT2细胞内的MAPK通路是LPS造模组与MVs干预组之间的显著差异通路之一;7.MVs干预明显抑制LPS造模组中PTEN和MAPK通路蛋白（p-p38、p-JNK、p-ERK）的表达,提高LPS造模组p-AKT的表达水平。结论:1.MVs在体内主要被AT2细胞和巨噬细胞摄取;2.MVs对产前LPS诱导大鼠BPD模型中的AT2细胞具有保护作用,促进其增殖并恢复表面活性物质SP-C的表达;3.MVs能减轻产前LPS引起的肺部炎症;4.MVs促进肺部发育并减轻炎症的机制可能与PTEN/AKT、MAPK通路有关。