背景结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）,一种常见的消化系统恶性肿瘤,具有发病率高、死亡率高及预后差等特点,已成为威胁人类健康的重大疾病。辅助化疗已成为局部不可切除及中晚期结直肠癌患者的重要治疗手段,可显著降低患者复发和转移的风险,延长患者生存时间。5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-Fu）和顺铂（Cisplatin,DDP）是广泛用于治疗结直肠癌的经典及基础化疗药物。然而,肿瘤细胞易对抗肿瘤药物产生耐药性,导致化疗疗效较差。因此,寻找耐药相关的关键基因,有望为逆转结直肠癌化疗耐药性提供新的方向。在人类基因组中,仅有2%的核酸序列可翻译成蛋白质,70%以上的基因组转录成非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）,ncRNA近年来备受瞩目,其可作为癌基因或抑癌基因在肿瘤中异常表达,从而影响肿瘤的多种生物学过程,如今ncRNA也成为了攻克肿瘤化疗耐药难题的希望。非编码RNA,如微小RNA（microRNA,miRNA）、长链非编码 RNA（longnon-coding RNA,lncRNA）、环状 RNA（circular RNA,circRNA）等,能够以RNA形式在多个层面上发挥生物学功能。现阶段仅有少量研究报道了某特定ncRNA在调控结直肠癌5-氟尿嘧啶或顺铂化疗耐药中的作用,尚未有研究报道ncRNA同时影响这两种化疗耐药。因此,寻找同时调控结直肠癌多种化疗耐药的ncRNA具有重要的研究意义。目的本研究利用全转录组测序技术寻找与结直肠癌5-氟尿嘧啶和顺铂耐药密切相关的ncRNA,研究关键RNA在结直肠癌化疗耐药中的作用,阐明关键lncRNA及circRNA 是否可以作为竞争性内源 RNA（competing endogenous RNAs,ceRNA）结合miRNA从而调控耐药基因表达影响化疗耐药过程,为逆转结直肠癌化疗耐药提供新的分子靶点和理论依据。方法第一部分:运用全转录组测序技术获得结直肠癌化疗耐药细胞中mRNA、lncRNA、circRNA及miRNA表达谱。以结直肠癌细胞株HCT8、结直肠癌5-氟尿嘧啶耐药细胞株HCT8/5-Fu及顺铂耐药细胞株HCT8/DDP为研究对象,提取三组细胞总RNA,质检合格后进行全转录组测序。以|log2FoldChange|＞1及P＜0.05为基准,筛选出与结直肠癌敏感细胞株HCT8相比,两种耐药细胞中显著差异表达的mRNA、lncRNA、circRNA及miRNA。随后,为了寻找同时调控5-氟尿嘧啶和顺铂化疗耐药的RNA,使用维恩分析筛选出两种耐药细胞中共同差异表达的mRNA及ncRNA,基于此使用生物信息学预测出与miRNA靶向结合的mRNA、lncRNA或circRNA,并构建竞争性内源 RNA 网络,即 lncRNA-miRNA-mRNA 和 circRNA-miRNA-mRNA网络。最后,对存在ceRNA关系的mRNA进行GO和KEGG pathway富集分析,以明确网络中目的基因主要的生物学功能和显著富集的通路。第二部分:LINC02418/miR-372-3p/EPHA2在结直肠癌化疗耐药中功能及机制研究。（1）在第一部分构建的lncRNA-miRNA-mRNA网络中,从目的基因显著富集的通路中寻找出与化疗耐药相关的通路,并进一步筛选出富集程度最显著的前3条通路中可能参与化疗耐药的基因,构建耐药相关的ceRNA网络,寻找关键基因,并确定 LINC02418/miR-372-3p/EPHA2 或 LINC02418/miR-33a-3p/EPHA2 为目标ceRNA 网络。（2）验证 LINC02418、miR-372-3p、miR-33a-3p 及 EPHA2 的生物学功能。qRT-PCR 法检测在三组细胞中 LINC02418、miR-3 72-3p、miR-3 3a-3p 及 EPHA2的表达,在耐药细胞株中干扰其表达,运用MTT实验及流式细胞术分别检测转染后细胞化疗敏感性、细胞增殖能力及细胞凋亡、周期变化情况。（3）LINC02418影响结直肠癌化疗耐药的分子机制。LncRNA可作为ceRNA发挥调控作用,故使用qRT-PCR 法检测耐药株中干扰 LINC02418 后 miR-372-3p、miR-33a-3p 的表达;qRT-PCR 及 Western Blot 检测干扰 LINC02418、miR-372-3p 或 miR-33a-3p 后下游 EPHA2的变化;双荧光素酶实验用于验证LINC02418与miR-372-3p以及miR-372-3p与EPHA2的靶向结合关系;qRT-PCR检测共转染LINC02418和miR-372-3p后EPHA2的表达水平,以验证LINC02418可作为miR-372-3p的竞争性内源RNA调控EPHA2表达。第三部分:hsacirc002482在结直肠癌化疗耐药中的功能及机制研究。（1）对差异表达的circRNA进行富集分析,并验证两耐药株中共同差异circRNAs表达水平。（2）在circRNA-miRNA-mRNA调控网络中,从目的基因中筛选出可能参与化疗耐药的基因,构建耐药相关的ceRNA网络,确定关键基因是hsacirc002482。（3）过表达关键基因hsacirc002482后检测耐药细胞化疗敏感性、细胞增殖及凋亡情况。qRT-PCR用于检测过表达hsacirc002482后下游miRNA及mRNA表达以探索其是否作为ceRNA发挥作用。结果第一部分:mRNA、lncRNA、circRNA及miRNA的表达谱:在进行全转录组测序之前,本研究验证了 HCT8/5-Fu和HCT8/DDP细胞较亲本株具有明显化疗耐药性,为后续研究奠定了基础。测序结果显示,HCT8/5-Fu和HCT8/DDP耐药细胞中分别有 2464 和 2378 个 mRNA、597 和 601 个 lncRNA、48 和 90 个 circRNA、98和79个miRNA发生差异表达,其中有1779个mRNA、295个lncRNA、11个circRNA和64个miRNA在两种耐药细胞中共同差异表达。基于共同差异表达的RNA,使用生物信息学方法预测了 miRNA对应的靶基因关系对,共构建了 1844条lncRNA-miRNA-mRNA 和 47 条 circRNA-miRNA-mRNA 调控网络。KEGG pathway富集分析显示lncRN A-miRNA-mRN A调控网络的靶基因主要富集在Ras、PI3 K-AKT及MAPK信号通路,circRNA-miRNA-mRNA网络中目的基因主要富集于MAPK、AMPK及TNF信号通路。第二部分:LINC02418/miR-372-3p/EPHA2在结直肠癌化疗耐药中的生物学功能及调控机制:（1）从lncRNA-miRNA-mRNA 网络中目的基因富集最显著的3条耐药相关通路中筛选出与肿瘤化疗耐药密切相关的基因及其调控网络,cytoHubba插件分析出耐药相关ceRNA网络中关键基因是促红细胞生成素诱导肝细胞受体（erythropoietin-producinghepatocellularreceptorA2,EPHA2）和 LINC02418,并确定 LINC02418/miR-372-3p/EPHA2 和 LINC02418/miR-33a-3p/EPHA2 为本课题研究对象。（2）LINC02418在结直肠癌耐药细胞株中显著高表达,敲低LINC02418后,耐药细胞的化疗敏感性增强,凋亡率显著增加,周期分布发生改变;miR-372-3p和miR-33a-3p在结直肠癌耐药细胞株中显著低表达,当过表达miR-372-3p和miR-33a-3p时,耐药细胞化疗敏感性增强、增殖能力降低、凋亡水平增加、周期分布改变;EPHA2具有酪氨酸激酶活性,在结直肠癌耐药细胞株中显著高表达,抑制其激酶活性可显著增加耐药细胞化疗敏感性、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、改变细胞周期分布。（3）在耐药细胞中敲低LINC02418后,miR-372-3p和miR-33a-3p的表达显著增加,其中miR-372-3p上调程度更显著;在耐药细胞中过表达miR-372-3p和miR-33a-3p时,EPHA2的表达明显下降,由miR-372-3p致使的EPHA2 下调程度更显著,故选用miR-372-3p用于后续调控机制研究。双荧光素酶实验结果显示miR-372-3p是LINC02418的下游靶标,EPHA2为miR-372-3p 下游靶基因;EPHA2的表达水平在沉默LINC02418的HCT8/5-Fu和HCT8/DDP耐药细胞株中下调,这一过程在共转染miR-372-3p抑制剂时得到有效逆转,提示LINC02418可能通过miR-372-3p/EPHA2轴影响结直肠癌化疗耐药。第三部分:hsacirc002482在结直肠癌化疗耐药中的功能及机制研究:（1）在HCT8/5-Fu和HCT8/DDP细胞中差异表达circRNA分别主要富集于DNA修复途径和Hippo信号通路。qRT-PCR用于验证11个共同差异表达的circRNA,验证结果与RNA测序结果一致。Hsacirc023607在耐药细胞系中的是上调程度最高的circRNA,但其并不影响结直肠癌的化疗敏感性。（2）在47条circRNA-miRNA-mRNA网络中,由cytoHubba插件分析出的关键基因hsacirc002482可调控与耐药形成相关的目的基因,如杆状病毒 IAP 重复序列 3（baculoviral IAP repeat containing 3,BIRC3）。（3）hsacirc002482在耐药细胞中低表达,其过表达可明显增强HCT8/5-Fu和HCT8/DDP细胞的化学敏感性,显著抑制耐药细胞的增殖且促进了细胞凋亡。此外,过表达hsacirc002482可明显抑制miR-34b-3p并增加BIRC3的表达,提示hsacirc002482可能通过miR-34b-3p/BIRC3轴在结直肠癌耐药中发挥重要作用。结论结直肠癌化疗耐药细胞株的RNA表达谱与敏感细胞株相比发生了显著改变,在 HCT8/5-Fu 和 HCT8/DDP 耐药细胞中有 1779 个 mRNA、295 个 lncRNA、11 个circRNA和64个miRNA共同差异表达,并基于此构建了 lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA。在 lncRNA-miRNA-mRNA 网络中,LINC02418 可作为 ceRNA 竞争性吸附miR-372-3p,间接调控下游EPHA2表达促进结直肠癌5-氟尿嘧啶和顺铂化疗耐药的产生。在circRNA-miRNA-mRNA网络中,hsacirc002482被认为是关键基因,过表达hsacirc002482可增加HCT8/5-Fu和HCT8/DDP细胞的化学敏感性,其可能通过miR-34b-3p/BIRC3轴影响化疗耐药。本课题探索了结直肠癌化疗耐药中新的作用机制,有望为逆转化疗耐药提供新的理论依据和作用靶点。