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【研究背景】食管癌(carcinoma of esophagus)是世界上最常见的八大恶性肿瘤之一,好发于食管粘膜上皮或腺体,死亡率位居第六。尽管近几年食管癌的手术和放化疗等治疗方法有较大进展,但食管癌具有术后复发率高并且预后差的特点。食管癌的组织学类型主要为鳞状细胞癌和腺癌,约占90%以上,在我国食管癌主要以鳞状细胞癌为主。所以,目前针对食管鳞状细胞癌发病机制及治疗方法的探索一直是研究的热点和难点。Micro RNA(mi RNA)分子是一种单链、非编码的长约17-25 nt小RNA分子,通过与靶基因的3-UTR区互补配对后对m RNA进行切割或者翻译抑制。Micro RNA分子在多种肿瘤发生中发挥着关键性的作用,被认为是一组新的致癌基因或抑癌基因。有研究表明micro RNA在食管鳞状细胞癌的发生发展中发挥重要作用。如,在食管鳞状细胞癌中mi R-21表达量增高并通过下调PTEN来调节肿瘤细胞的增殖和侵袭性;而mi R-203和mi R-205表达量降低,并分别通过Np63和ZEB2通路抑制食管鳞状细胞癌细胞的增殖活性。因此micro RNA可以作为一种新的并行之有效的生物标志物,对发现和研究食管鳞状细胞癌新的发生和发展机理,寻找早期诊断和治疗的新基因靶位具有重要意义。【研究目的】1、分析mi R-1差异表达与食管鳞状细胞癌的相互关系;2、观察mi R-1对食管鳞状细胞癌细胞生物学功能的影响,探讨mi R-1在食管鳞状细胞癌发生中的作用,并对其作用机制进行初步研究。【方法】1、通过mi RNA基因芯片检测食管鳞状细胞癌组织同正常食管粘膜组织之间的mi RNA表达谱差异;2、通过实时定量PCR对芯片结果进行验证并筛选出目的分子mi R-1;3、扩大样本量,应用实时定量PCR观察mi R-1在食管鳞状细胞癌中的表达及其与临床病理特征的相关性;4、体外实验应用实时定量PCR技术检测mi R-1在食管鳞状细胞癌细胞系中的表达;5、将mi R-1的模拟物与抑制物及相应对照分别转染ECa109细胞和KYSE410细胞,通过MTT、平板克隆实验、划痕实验及Transwell侵袭实验检测mi R-1的生物学功能;6、裸鼠皮下食管鳞状细胞癌细胞注射成瘤,原位注射mi R-1激动剂、激动剂对照及生理盐水,体内观察mi R-1的生物学功能;7、生物信息学软件预测mi R-1的靶基因并筛选出PREX1基因;8、双荧光素酶报告基因实验验证靶基因PREX1同mi R-1的直接作用;9、应用实时荧光PCR检测食管鳞状细胞癌细胞系中PREX1 m RNA的表达情况;10、ECa109细胞系中转染了mi R-1的模拟物及对照,Real-time PCR检测PREX1的m RNA,Western blot检测PREX1的蛋白表达变化;11、应用免疫组织化学染色检测PREX1在食管鳞状细胞癌组织中的表达,并分析与mi R-1表达的相关性。【结果】1、对食管鳞状细胞癌组织及正常食管粘膜组织的mi RNA表达谱统计分析结果显示:将P<0.05且表达差异大于2倍作为筛选标准,获得的mi RNA差异表达分子共43个,包括27个在癌组织里低表达mi RNA和16个在癌组织中高表达mi RNA。表达差异倍数大于4倍的mi RNA分子共24个,15个在癌组织中表达下调和9个在癌组织中表达上调。2、聚类分析结果显示mi RNA表达谱在食管鳞状细胞癌组织及正常食管粘膜上皮两组内分类明显。9个差异表达mi RNA的实时定量荧光PCR检测结果同其mi RNA芯片检测结果一致,说明芯片结果真实可靠,经过综合分析后选取mi R-1作为研究对象。3、实时定量荧光PCR检测结果显示mi R-1在食管鳞状细胞癌组织中表达量下降明显。90.6%(58/64)的患者食管鳞状细胞癌组织中mi R-1的表达较正常组织下调超过50%(下调倍数大于2倍),并且统计分析显示mi R-1的表达水平与食管鳞状细胞癌肿瘤浸润深度及临床分期显著相关。4、mi R-1在5种ESCC细胞系中表达量都显著降低,转染上调mi R-1表达量后,ESCC肿瘤细胞增殖活性下降,克隆形成能力减弱,而抑制mi R-1的表达,则使肿瘤细胞的增殖速度上升,克隆形成能力增强。同时提高mi R-1表达量可以抑制肿瘤细胞的迁移及侵袭能力,降低mi R-1表达量,可显著增强肿瘤细胞的迁移及侵袭能力。体内实验亦证明mi R-1能显著抑制食管鳞状细胞癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力。5、三个生物学软件预测得到共同的181个mi R-1下游靶基因,基因功能聚类分析发现,这些mi R-1下游靶基因与转录因子活性、DNA特异性结合、信号传导、转录调节及血管生成等生命过程密切相关。6、双荧光素酶报告基因实验发现mi R-1可显著性抑制含有其结合位点的PREX1野生型质粒荧光蛋白的表达,但对于突变型和对照质粒荧光蛋白的表达无明显影响。7、实时定量荧光PCR检测结果显示mi R-1与PREX1在食管鳞状细胞癌细胞系中的表达呈负相关关系。与对照组相比,转染上调mi R-1表达量后PREX1的m RNA表达及蛋白表达水平均明显下降。8、免疫组织化学染色显示PREX1蛋白表达于细胞胞浆内,且食管鳞状细胞癌组织中的表达明显高于正常的食管粘膜组织,存在显著性差异,并与mi R-1表达呈负相关性。【结论】mi R-1在食管鳞状细胞癌中表达明显下调并且能够抑制肿瘤的增殖、迁移及侵袭,其作用机制可能是通过抑制其靶基因PREX1表达,进而可能通过Rac通路在食管鳞状细胞癌发生发展中发挥作用。本研究为食管鳞状细胞癌的诊断及个体化治疗新的潜在分子标志物奠定理论基础。