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背景和目的:自身免疫疾病（ADs）是免疫系统异常攻击自身组织器官造成的疾病。抑制过度免疫反应是目前治疗此类疾病的基本策略,也是药物研发的主要方向。不过现有的直接针对免疫细胞或免疫效应分子的免疫抑制剂很难达到理想的治疗效果并且多数药物具有一定的毒副作用。那么,能否有其他策略来调控患者体内过度的免疫反应?中西医理论均认为ADs发病有内因和外因两方面,西医理论认为ADs的发病的内因是“遗传因素”而外因是“环境因素”,并且近期研究表明环境因素中最为关键的是肠道微生态失衡（有害菌和有害代谢产物增多）。中医理论认为导致ADs的内因是“正气虚”而外因是“邪气盛”,不过正虚邪盛的病理学机制和生物学基础尚不清楚。本论文在此结合中西医理论提出“肠道微生态失衡引起‘营卫失调’和‘正虚邪盛’是导致ADs的关键”的理论假说,基于这一假说,改善肠道微生态可能是治疗ADs的有效策略并且同时符合中西医理论。菊糖是一种β-2,1连接的果聚糖,已被广泛报道具有调节肠道微生态的作用。在此,本论文提出“菊糖可通过调节肠道微生态改善ADs”的科学假设,并在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠（EAE）和胶原诱导性关节炎小鼠（CIA）模型上验证这一假设是否成立。以期为将菊糖开发为ADs治疗或辅助治疗药物奠定基础,并为以肠道微生态为靶标的ADs药物研发提供一定依据,且可以丰富和发展自身免疫疾病相关中医理论的科学内涵。方法:1.三种中药牡蒿、党参、木香中的菊糖的提取分离纯化和结构鉴定:由于市场所售菊糖一般是混合物,本论文依据前期工作基础选择从牡蒿、党参、木香三种中药中进行均一菊糖的提取分离纯化及结构鉴定,具体方法如下:水提醇沉法获取粗多糖;粗多糖经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换色谱分离中性多糖,中性多糖经Superdex-75凝胶色谱柱纯化得到菊糖;对纯化出的多糖的结构表征包括采用高效凝胶渗透色谱（HPGPC）测定多糖分子量和均一性;气相-质谱联用（GC-MS）确定单糖组成;红外色谱（IR）检测多糖特征峰以及是否含糖醛酸;甲基化反应分析多糖中各单糖连接方式;核磁共振波谱（NMR）最终明确结构特征。2.三种不同分子量菊糖的免疫活性研究:采用细菌脂多糖（LPS）刺激巨噬细胞RAW264.7炎症模型和刀豆蛋白（Con A）诱导的淋巴细胞增殖模型以明确菊糖是否直接具有免疫抑制活性。方法如下:CCK-8法检测菊糖对RAW264.7细胞的细胞毒性,Griess法检测一氧化氮（NO）分泌,Elisa法检测炎症因子分泌;使用Con A诱导淋巴细胞增殖,CCK-8法检测细胞增殖。3.菊糖调节肠道微生态治疗EAE小鼠的研究:MOG35-55、CFA联合PTX诱导小鼠EAE模型,口服菊糖进行干预并每天记录临床评分;HE染色和LFB染色检测脊髓炎性脱髓鞘病变,免疫组化检测免疫细胞在脊髓的浸润,RT-PCR检测脊髓炎症因子和趋化因子基因表达,以明确菊糖的药效及对脊髓病理变化的保护作用;16Sr DNA测序检测肠道菌群变化,气相色谱检测粪便短链脂肪酸,以明确菊糖对肠道微生态的改善;HE染色和免疫组化观察结肠组织形态变化,流式分析MLN中CD103+CD11c+DC、M1和M2型巨噬细胞以及Ig A+B220+B细胞的比例,RT-PCR检测结肠组织炎性基因表达,以明确菊糖对肠道屏障和免疫的影响;Elisa检测血清和细胞上清炎症因子水平,流式分析脾脏免疫细胞亚群变化,3H-Tdr掺入法检测淋巴细胞再反应性增殖,RT-PCR检测转录因子和细胞因子基因表达,以明确菊糖对系统免疫应答的影响;腹腔注射给药、粪菌移植、高脂饲料干扰以明确肠道微生态与菊糖药效之间的因果关系;体外淋巴细胞增殖抑制活性及机制研究以明确SCFAs对于菊糖药效的贡献。4.菊糖调节肠道微生态治疗CIA小鼠的研究:牛Ⅱ型胶原诱导CIA模型,口服菊糖进行干预,对病情进行评分,HE染色和甲苯胺蓝染色检测关节组织病变,以明确菊糖的药效;16Sr DNA测序检测肠道菌群变化,以明确菊糖对肠道微生态的改善;HE染色和免疫组化观察结肠组织形态以及紧密连接变化,RT-PCR检测肠组织炎性基因表达,以明确菊糖对肠道屏障和炎症的调控;Elisa检测血清和细胞上清炎症因子水平,流式分析脾脏免疫细胞亚群变化,RT-PCR检测转录因子和细胞因子基因表达以明确菊糖对系统免疫应答的影响;粪菌移植实验以明确肠道微生态与菊糖药效之间的因果关系。结果:1.从牡蒿、党参、木香中纯化得到三个不同分子量的均一菊糖:牡蒿粗多糖得率为3.86%,经DEAE-Sepharose Fast Flow柱和Superdex-75柱分离纯化后得到均一多糖MWP,HPGPC计算MWP分子量为3.1 KDa,GC/MS分析其糖组成为果糖和葡萄糖,红外结果表明MWP具有多糖特征吸收峰以及果糖β糖苷键的吸收峰,甲基化分析其连接方式为2,1-连接,核磁结果表明葡萄糖的C-1通过糖苷键连在果糖的C-2上,以上结果说明MWP是典型的菊糖。党参和木香粗多糖的得率分别为16.8%和4.1%,经过DEAE-Sepharose Fast Flow柱和Superdex-75柱分离纯化后分别得到均一多糖CWP和AWP,分子量分别为4.8KDa,2.2 KDa,NMR结果表明这两个均一多糖均为典型的菊糖。2.三种菊糖均不具有免疫抑制作用:MWP、CWP以及AWP对RAW264.7细胞均无细胞毒性,并且不能够抑制LPS诱导的NO和IL-6分泌;MWP、CWP以及AWP对Con A诱导的淋巴细胞增殖均不具有抑制作用。3.菊糖可以通过调节肠道微生态改善EAE小鼠病情:MWP、CWP以及AWP均可以改善EAE小鼠病情,其中MWP药效略好,提示本课题中菊糖的药效与其分子量大小无明显相关性,并且菊糖（MWP）的药效无明显剂量依赖性,中剂量组（200 mg/kg）表现出较好的药效;菊糖给药可以降低EAE发病率,以及改善脊髓炎性脱髓鞘病变,减少免疫细胞浸润至脊髓并降低脊髓中炎症因子和趋化因子基因表达;EAE小鼠与正常小鼠相比出现了肠道微生态失衡并且肠形态学发生变化且有一定程度炎症反应,说明EAE小鼠体内可能存在营卫失调的病机表现,而菊糖给药可以改善EAE小鼠肠道微生态,包括调节拟杆菌门和厚壁菌门比例,减少Odoribacter菌属比例,且增加粪便中SCFAs含量;菊糖给药保护了肠黏膜屏障（减轻结肠病理变化）并诱导肠道免疫耐受（增加CD11C+CD103+DC细胞和M2型巨噬细胞比例）,减少炎性基因表达;菊糖给药抑制了系统免疫应答,表现为降低血清炎症因子水平,降低淋巴细胞自身反应性增殖,降低脾脏抗原提呈细胞比例,调节Th17细胞和Treg细胞的平衡（降低IL-17基因表达以及上清液中浓度,增加IL-10基因表达及上清液中浓度）;菊糖对于肠道微生态的调控与其药效存在因果关系:腹腔注射给药无效,粪菌移植有效,高脂饲料干扰后药效被抵消;而且菊糖的代谢产物乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠体外都具有免疫调节活性,其中丁酸钠免疫抑制活性最好,可以剂量依赖地抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应以及Con A诱导的淋巴细胞增殖反应,而且在体实验表明丁酸钠（1 m M）可以显著抑制MOG35-55引起的EAE小鼠淋巴细胞再反应性增殖而菊糖（200μg/m L）无此作用,进一步分析发现丁酸钠可以增加淋巴细胞中Treg细胞比例并抑制Th17细胞比例,并且加入组蛋白乙酰转移酶抑制剂MG149后其免疫调节作用消失,提示丁酸钠的免疫调节活性可能依赖于组蛋白乙酰化水平。以上结果提示菊糖发挥药效依赖于其对肠道微生态包括菌群结构和代谢产物的调节。4.菊糖可以通过调节肠道微生态改善CIA小鼠病情:菊糖（200 mg/kg/只）灌胃给药可以明显降低CIA小鼠的临床评分且减轻脚肿胀,减少关节部位炎性细胞浸润和软骨损伤;CIA小鼠与正常小鼠相比出现了肠道微生态失衡并且肠形态学发生一定变化,而菊糖治疗可以调节肠道微生态,包括增加拟杆菌门比例,降低厚壁菌门比例,以及增加有益菌S24-7和乳酸菌属等,减少有害菌odoribacter菌属比例;菊糖给药保护了肠黏膜屏障（减轻结肠病理变化）,减少炎性基因表达;菊糖给药抑制了CIA小鼠系统免疫应答,表现为降低血清炎症因子水平,降低脾脏抗原提呈细胞比例,调节Th17细胞和Treg细胞的平衡（降低IL-17基因表达以及上清液中浓度,增加IL-10基因表达及上清液中浓度）;并且粪菌移植可以改善EAE小鼠病情提示菊糖对肠道微生态的调控与其药效存在因果关系。结论:EAE小鼠和CIA小鼠均出现了肠道微生态失衡（菌群结构失调和代谢产物变化）,并且表现出肠形态学变化（绒毛减少,）,肠道炎症（IL-17、IL-6基因表达增高,IL-10、TGF-β基因表达降低）等变化,说明这两种自身免疫疾病具有“营卫失调”和“正虚邪盛”的特点,为本论文提出的假说提供了实验基础。而菊糖给药可以改善EAE和CIA小鼠的肠道微生态（菌群结构和代谢产物）,并且恢复肠黏膜屏障和调节肠道免疫应答（增加耐受型免疫细胞比例并增加抑炎因子IL-10和TGF-β基因表达水平）,进一步地调节了系统免疫应答（增加Treg细胞比例并减少Th17细胞比例,以及增加IL-10浓度并降低IL-17浓度）,从而发挥了对EAE和CIA的改善作用;进一步的粪菌移植实验提示肠道微生态与菊糖药效存在因果关系。以上实验结果证明了“菊糖可以通过调节肠道微生态治疗ADs”的科学假设,提示菊糖具有开发为ADs治疗药物的潜力。