人肝癌细胞SMMC-7721的核酸适配体筛选与序列设计及研究应用

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癌症的早期诊断、准确分型及靶向治疗是生物医学领域最具挑战性的难题之一。从分子水平上发展能够特异性识别癌症细胞的生物分子识别探针实现对癌症的早期诊断、转移预警和疗效评估等具有非常重要意义。近年来发展起来的cell-SELEX技术能在对靶标细胞上特定靶分子未知的情况下筛选获得能特异性性识别靶标的核酸适配体探针,为肿瘤特异标志物的发现、癌症的临床诊断与分型、肿瘤发生和发展机制研究提供一种全新的思路和方法。本文以人肝细胞肝癌(HCC)为研究对象,在cell-SELEX平台上筛选能够高度特异性识别HCC细胞系的核酸适配体,对其识别性能进行表征并进行初步研究应用,主要内容如下:(1)核酸适配体的筛选以HCC细胞系SMMC-7721为靶标,以HCC细胞系HepG-2为对照细胞,建立cell-SELEX平台。筛选过程通过不断增加筛选压力,提高了筛选效率,仅用13轮筛选即达到筛选平台期,且文库中序列富集度很高。其中富集度最高的四条链均能与靶细胞结合。进一步表征表明这四条核酸适配体对靶细胞的解离常数均在纳摩尔级别,具有高度的结合特异性,且在室温与体温下良好的保持了识别性能。(2)核酸适配体的结构分析与设计对筛选过程及筛选终点的序列进行进化分析,并分析核酸适配体的二级结构与结合能力之间的关系。通过一级序列同源性分析和二级结构分析又从13轮文库中选出了五条结合性能优秀的核酸适配体。根据核酸适配体(ZY1、ZY8、ZY11)的结构信息及裁剪实验,发现核酸适配体是以特定的stem-loop-stem构型与细胞结合,经过优化设计可在保持其结合性能的同时缩短和替换茎部核苷酸序列。同时还根据核酸适配体的结构特点,设计了基于FRET信号的诱导型裂开式核酸适配体(split aptamer),split aptamer能够在靶标存在的情况下结合形成特定构型并释放信号。(3)核酸适配体的应用为了考察核酸适配体在复杂生物环境下还能不能保持识别性能,表征了核酸适配体与肿瘤冰冻切片以及小鼠活体肿瘤的结合情况。实验结果表明核酸适配体在复杂环境中仍能保持良好的识别能力,并且保持了高度的组织特异性。
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